王晓慧, 谈世进

（1苏州大学医学部老年医学专业2010级, 苏州 215123; 2上海交通大学附属第六人民医院老年科, 上海 200233）

高盐负荷下血压升高的特性被称作血压的盐敏感性，由高盐引起的血压升高为盐敏感性高血压。雄激素的作用十分广泛，在心血管系统中起重要作用，在雄性个体中，雄激素的浓度及活性随年龄的增长而降低[1]。在雄激素中，起主要生理活性作用的是睾酮。笔者之前的研究表明，高雄激素水平可促进高盐喂养下雄性大鼠血压的升高，而去势处理可以降低高盐喂养所引起的血压升高幅度[2]。其他学者的研究也有类似发现[3]。而雄激素对盐敏感高血压的影响机制尚未完全阐明，血管内皮在调节体内心血管生理功能、维持血压的平衡中起着极其重要的作用，雄激素影响高盐饮食下大鼠的血压水平，是否与内皮功能的变化有关，值得关注。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是主要存在于血管内皮中，可特异性地刺激血管内皮细胞增殖的活性肽[4]，推测VEGF作为有效的血管生成因子、内皮细胞特异性有丝分裂原和强烈的血管通透因子[5]，其含量的变化可对内皮功能产生重要影响。本实验通过建立高盐饮食雄性大鼠实验模型，探讨不同水平的睾酮对高盐饮食下雄性大鼠血管VEGF的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级雄性Wistar大鼠32只，8周龄左右，体质量（200±10）g，由上海西普尔-必凯实验动物公司提供。

1.2 实验药物

丙酸睾酮注射液（上海通用药业股份有限公司，生产批号100404）；氟他胺片（flutamide，上海复旦复华药业有限公司，生产批号110902）；盐酸氯胺酮注射液（福建古田药业有限公司，生产批号101103）。

1.3 主要试剂

大鼠睾酮、VEGF酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（Biotech公司）。

1.4 主要仪器

电子称，自动平衡离心机，高速冷冻离心机（BECKMAN公司），超低温冰箱（Sanyo 公司，中国），酶标仪（美国BioTek公司，型号ELx800），荧光定量PCR仪（FTC3000型），多样品组织研磨机（净信科技公司，Tissuelyser-24型）。

1.5 实验方法

1.5.1 实验模型与分组 32只雄性Wistar大鼠随机分为4组：假手术组（Sham组），去势组（Cas组），去势后补充睾酮组（TC组），去势后补充睾酮和氟他胺组（FTC组）。每组8只。全部在适应性喂养2周后开始实验。Cas组、TC组及FTC组大鼠均施以去势手术。2ml/kg体重盐酸氯胺酮腹腔注射麻醉后，碘伏消毒阴囊处皮肤，沿纵膈正中切开一纵形切口，剪开鞘膜后，分别将双侧睾丸与附睾分离并切除睾丸，然后把附睾放回阴囊，青霉素冲洗切口预防感染，缝合切口。Sham组只睾丸与附睾的分离处理，不做切除，然后放回阴囊，青霉素冲洗并缝合切口。各组大鼠术后均用2×105U青霉素连续腹腔注射3d预防感染。

1.5.2 动物饲养与给药 手术后各组均以8%氯化钠高盐颗粒饲料喂养，自由摄食，自由饮用自来水，TC组、FTC组给予丙酸睾酮2mg/kg、皮下注射、隔日1次[6]，其余各组分别以等量的玉米油皮下注射，FTC组同时给予氟他胺1mg/kg、每日1次灌胃，其余组以等量的生理盐水灌胃。

1.5.3 采集血样及组织 高盐饲料喂养8周后取材。氯胺酮2ml/kg腹腔注射麻醉后，剖开胸腔，充分暴露心脏并于右心房处采血，注入普通管，管口封好后放入4℃冰箱中1～2h，然后取出以2500r/min的速度离心10min，分离上清并分装，-80℃冰箱冻存备用。采血后迅速分离并剪取胸主动脉及腹主动脉，生理盐水冲洗干净后置-80℃冰箱冻存备用。

1.5.4 ELISA法测定血清中睾酮和VEGF浓度 将待测血清样本置冷水中复融，采用ELISA法测定，严格按照试剂盒说明操作。

1.5.5 RT-PCR测定血管内皮中VEGF mRNA的表达 按说明抽提总RNA，核酸分析仪测定RNA样品浓度，A260nm/A280nm在1.8～2.0之间，说明提取的RNA纯度高，无蛋白质和DNA的残余。取1.6µg RNA为模板反转录为cDNA。PCR引物：VEGF上游5′-CCTGGCTTTACTGCTGTACCT-3′，下游5′-GCTGGTAGACGTCCATGAACT-3′；GAPDH上游5′-GACGCTTTGGTGAAGAAACTGA-3′，下游5′-CACACGGCAATAAATGACATGAG-3′。产物用2%琼脂糖凝胶电泳，对照相对分子质量标准检测扩增结果，凝胶成像分析系统对目的DNA条带进行扫描，并采用BandScan 5.0凝胶图像分析软件进行吸光度（A）值分析。软件自动算出每个基因Ct值的均数及标准差，并计算出mRNA相对于内参GAPDH的表达量，以各组VEGF与自身GAPDH吸光度值的比值作为各组细胞中VEGF mRNA的相对含量（M）。

1.6 统计学处理

计量资料以±s表示，数据处理采用SPSS16.0统计软件，各组间均数比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），满足方差齐性的多重比较采用LSD法，不满足方差齐性的多重比较采用非参数检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠的血清睾酮和VEGF浓度

与Sham组相比，Cas组血清睾酮浓度明显降低（P＜0.01），TC组差异则无统计学意义，FTC组升高近2倍（P＜0.01）。与Sham组相比，Cas组、FTC组大鼠血清VEGF浓度明显升高（分别为P＜0.01，P＜0.05），TC组大鼠无明显差异（P＞0.05；表1）。

表1 各组大鼠血清睾酮、VEGF浓度Table 1 Serum testosterone and VEGF contents in rats (n＝8,±s)

表1 各组大鼠血清睾酮、VEGF浓度Table 1 Serum testosterone and VEGF contents in rats (n＝8,±s)

VEGF: vascular endothelial growth factor; Sham group: control group;Cas group: castration group; TC group: testosterone supplement after castration group; FTC group: flutamide-treated testosterone supplemented castrated group.Compared with Sham group, *P＜0.05, **P＜0.01

Group Testosterone(ng/L) VEGF(µg/L)Sham group 3.15±0.54 20.837±13.828 Cas group 0.26±0.02** 47.246±19.733**TC group 2.80±0.30 22.870±12.057 FTC group 5.47±1.29** 46.043±22.070*

2.2 各组大鼠的血管内皮中VEGF mRNA表达

与Sham相比，Cas组、FTC组大鼠血管内皮VEGF mRNA 表达水平明显升高（均P＜0.01）；TC组差异则无统计学意义（P＞0.05；图1，图2）。

图1 RT-PCR检测血管内皮中VEGF mRNA的含量Figure 1 VEGF mRNA expression in vascular endothelium

3 讨 论

众所周知，高盐饮食可以对血压产生重要影响。在此基础上，既往研究又发现高盐诱导下，高雄激素水平对雄性大鼠血压的升高有促进作用，通过去势处理降低雄激素水平可相应的降低血压水平。但雄激素在此过程中具体的作用机制尚未完全阐明。

图2 血管内皮中VEGF的相对表达Figure 2 Relative VEGF expression in endothelial cells

Hu等[7]的研究表明，雄激素可能是通过激活肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin-system，RAS），促进高盐饮食下大鼠血压的升高，同时也加重了肾脏的损伤。RAS不是血压调节中唯一起作用的途径，血管内皮在血压调节中也起重要作用。Oloyo等[8]研究发现，SD大鼠的主动脉环对乙酰胆碱的最大舒张效应在高盐饮食下降低，而在去势处理后升高，如果在去势的基础上补充生理剂量的睾酮，舒张效应又转为降低，提示雄激素可能通过直接作用于血管内皮产生影响。

血管内皮是介于循环血液与血管平滑肌细胞之间的，能够合成、分泌多种重要血管活性物质的生理屏障。VEGF主要存在于血管内皮细胞，为特异刺激血管内皮细胞增殖的活性肽，可刺激血管内皮细胞分化、移行、增生和管腔形成，是一种强有力的促血管生成因子[4]；可增加血管的通透性及参与新生血管的形成[9]；同时还可以选择性地增强血管内皮细胞的有丝分裂，刺激内皮细胞增殖[10]。因此，VEGF含量的变化可对血管内皮的功能产生重要的影响。

临床研究发现，高血压人群血清VEGF含量明显高于正常血压人群[11]。刺激VEGF分泌的因素主要有缺血、缺氧、牵拉、炎症细胞因子等，其中最主要的为缺血和缺氧。血压升高导致血管内皮局部环境的缺血、缺氧，刺激VEGF分泌，而VEGF可以促进血管内皮细胞的分裂、增殖，同时增加血管的通透性，使血管中过多的水分渗入到组织中，可对高血压起代偿作用。

另一方面，在抗肿瘤药物的研究中，抑制VEGF信号通路的药物是最新的抗肿瘤药物之一，多位学者在研究中发现该类药物最明显的副作用是造成血压升高[12,13]，也从侧面证明VEGF可对血压的变化产生有益的代偿作用。在本实验中，雄激素完整组（Sham组和TC组）的大鼠血清VEGF浓度较低，低雄激素水平组（Cas组）的大鼠血清VEGF浓度较高，FTC组虽然睾酮浓度最高，但由于雄激素受体（androgen receptor，AR）阻滞剂氟他胺的作用，睾酮作用不能得到发挥，故VEGF浓度也较高。同时血管内皮中VEGF mRNA的表达也呈现类似的水平。由此推测，雄激素可能抑制了VEGF的表达与释放，导致VEGF水平降低，因而由高盐饮食造成的内皮损害得不到相应的代偿性修复，使血管内皮细胞的功能受损。VEGF本身可通过刺激血管内皮细胞的分裂、增殖，增加血管壁的通透性等作用对血管内皮的功能产生影响，同时有学者研究发现，VEGF还可调控一氧化氮合酶的表达而对血管内皮产生影响[14,15]。

雄激素发挥作用主要是通过AR，AR主要位于睾丸间质细胞核内，也存在于神经系统、肾及肾上腺、大部分心房及心室肌、主动脉、冠状动脉中，这也是雄激素作用广泛的原因。Lin等[16]最早发现血管壁中存在AR，血管壁各层均有分布，以内层为主。氟他胺是一种非类固醇类抗雄激素药物，主要通过抑制靶细胞受体对睾酮的摄取和（或）结合，进而干扰雄激素作用[17]。在本实验氟他胺组，即使睾酮浓度很高，也不能正常发挥作用，表明雄激素主要是通过AR发挥作用。

本研究表明，以睾酮为代表的雄激素可对高盐饮食大鼠的VEGF水平产生影响，高浓度雄激素可降低VEGF水平，而低浓度则导致VEGF升高，且这种影响是通过AR进行的。但确切的影响机制尚需进一步证实。雄激素可能通过影响VEGF的水平直接影响血管内皮功能，这可能是雄激素影响盐敏感高血压作用的机制之一。

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