靳取 邓悦 常立萍

近期研究发现，炎症在高血压的发生中扮演了一个重要的角色［1］。Toll 样受体4 可参与人体中多种炎症过程［2］，促进人体血清中超敏C 反应蛋白(high-sensitivity C-reactive protein，HS-CRP)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor -a，TNF-a)、白介素1β(interleukin-lβ，IL-1β)等炎症因子的过多表达，引发炎症反应［3］，最终导致高血压病的发生。比格列酮是噻唑烷二酮类药物(thiazo-lid inediones，TZD)，为一类新型的人工合成的过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators activated receptors，PPAR-γ)激动剂，除了通过改善胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)而发挥降糖作用以外，更可以降低血压［4］。本实验从中医角度入手，采用潜阳解毒通络饮对自发性高血压大鼠(SHR)进行治疗观察，与阳性药缬沙坦和比格列酮作对比，通过ELISA 法和RTPCR 等方法检测大鼠血清和心脏组织中炎症因子的表达，来验证潜阳解毒通络饮在治疗高血压病中医证候中“风痰瘀络”证型的作用与疗效。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性12 周龄原发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)71 只，魏-凯二世大鼠(Wistar-Kyoto rats，WKY)10 只(北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号:SCXK(京)2012-0001)。潜阳组后因打斗死亡3 只。

1.2 主要试剂与药物

大鼠血清因子HS-CRP、TNF-a、IL-1β 的ELISA试剂盒，购于安迪(上海)生物科技有限公司［R＆D Systems (Minneapolis，MN，USA)］。

潜阳解毒通络饮:夏枯草25 g、石决明25 g、莱菔子15 g、黄连15 g、丹皮25 g、泽泻15 g、丹参15 g、地龙15 g、牛膝25 g(0.389 g/ml)。潜阳组药物:夏枯草25 g、石决明25 g、地龙15 g(0.144 g/ml)。解毒组药物:莱菔子15 g、泽泻15 g、丹参15 g、黄连15 g(0.133 g/ml)。通络组药物:丹皮25 g、丹参15 g、地龙15 g、牛膝25 g(0.178 g/ml)。缬沙坦:80 mg/粒(0.4 g/ml)。吡咯列酮:30 mg/粒(0.3 g/ml)。

将上药用清水浸泡30 分钟，6～8 倍水煮2 次，每次煎1.5 小时，待将至常温后取汁，4℃冷藏。

1.3 主要仪器和设备

酶标仪(美国宝特Bio-Tek ELX800 全自动酶标仪)，大鼠尾动脉无创测量仪Coda20208(美国Kent scientific corporation)，RT-PCR 仪(GT9612)(北京百泰克生物技术有限公司)，紫外分析仪(ZF1-II)(上海嘉鹏科技有限公司)，凝胶成像仪［伯乐生命医学产品(上海)有限公司，Bio-Rad Laboratiories，USA］。

1.4 动物分组

将SHR 随机分为潜阳组、解毒组、通络组、全方组、缬沙坦组、吡格列酮组、SHR 空白对照组及正常血压对照组，适应性喂养1 周，自由饮水，室温(20 ±2)℃，高脂饲料。生药量分别为:潜阳组0.22 g/kg(0.8 ml/天)、解毒组0.15 g/kg(0.65 ml/天)、通络组0.27 g/kg(0.9 ml/天)、全方组0.58 g/kg(1.95 ml/天)、缬沙坦组0.00027 g/kg(0.16 ml/天)、吡格列酮组0.0001 g/kg(0.1 ml/天)，SHR 对照组及空白对照组每日给予生理盐水，计量与全方组相同0.58 g/kg(1.95 ml/天)。分别于药前及给药后2、4、6、8 周时采用大鼠尾动脉无创血压测量仪Coda20208测量大鼠安静清醒状态下尾动脉收缩压(SBP)，测量时间固定于测量日早上9∶00～12∶00。每只鼠连续测量SBP 3 次，间隔1～2 分钟，取平均值。

1.5 标本采集

喂养8 周后，给予25%的乌拉坦腹腔注射，麻醉后经腹主动脉取血4 ml，加入无任何处理的试管中，4℃，3000 r/min 离心10 分钟，取血清-80℃保存，用于炎性因子水平的检测;经腹主动脉取血后，立即打开胸腔，迅速取出心脏，冰生理盐水冲洗后，垂直于左心室长轴切取左室中部组织，经液氮速冻后置-80℃冰箱保存备用。

采用大鼠血清因子ELISA 试剂盒测各组标本血清中HS-CRP、TNF-a、IL-1β 的浓度。

RT-PCR 法监测大鼠心肌组织中TNF-a、TLR4及PPAR-γ 的mRNA 的表达。全方组、解毒组、潜阳组、通络组、沙坦组、列酮组、SHR 组及Control 组在高脂饲料喂养8 周后处死，取心肌组织，用SimplyP总RNA 提取试剂盒提取上述组织的总RNA，测定纯度并定量后采用BioRT cDNA 第一链合成试剂盒使用说明书合成第一链cDNA，于(北京百泰克生物技术有限公司GT9612)PCR 仪行RT-PCR 反应。目的基因TNF-a，Forward Primer:5‘-TCTCAAAACTCGAGTGACAAG-3'，Reverse Primer:5'-AGTTGGTTGTCTTTGAGATCC-3'，产物长度446 bp;TLR4 Forward Primer:5'-ATTTCTTGGCTTGATCAGTC-3'，Reverse Primer:5'-GGATGTCTCTATGCGATTG-3'，产物长度280 bp;PPAR-γ Forward Primer:5'-TCAGGTTTGGGCGAATG-3'，Reverse Primer:5'-TTTGGTCAGCGGGAAGG-3'，扩增产物长度152 bp;β-actin内参照物，Forward Primer:5'-CCCATCTATGAGGGTTAC-3'，Reverse Primer:5'-TCACGCACGATTTCC-3'，特异性扩增片段为143 bp。反应条件为:94℃预变性3 分钟;94℃变性30 秒，52℃退火30 秒，72℃延伸60 秒，72℃最后延伸5 分钟，共30 个循环。反应结束，由凝胶成像仪(Bio-Rad Laboratiories，USA)进行拍照后，用Alpha VIEW SA 分析软件进行分析。

1.6 统计学分析

采用SPSS 13.0 统计软件对数据进行分析。各组实验数据以表示，采用单因素方差分析(one-way ANOVAS)，以P ＜0.05 为有统计学意义，以P ＜0.01 有显著统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠尾动脉收缩压

治疗前，各治疗组间大鼠尾动脉收缩压经单因素方差分析，F=1.024，P =0.422，P ＞0.05，差异无统计学意义;治疗第8 周，各治疗组间大鼠尾动脉收缩压经单因素方差分析，F=2.352，P=0.032，P ＜0.05，差异有统计学意义，经两两比较后发现，全方组与正常血压对照组血压差异有统计学意义(P ＜0.05)。见表1。

表1 治疗前、治疗第8 周各组大鼠的尾动脉收缩压(±s)

表1 治疗前、治疗第8 周各组大鼠的尾动脉收缩压(±s)

注:与正常血压对照组相比，aP ＜0.05，bP ＜0.01

组别n第1 周血压(mmHg) 第8 周血压(mmHg)全方组11179.0 ±11.84135.7 ±23.80 b解毒组10181.7 ±18.05147.2 ±22.12a潜阳组7182.6 ±20.64142.0 ±13.96a通络组10177.4 ±11.95135.6 ±31.25b沙坦组10174.9 ±12.19136.1 ±8.57b列酮组10182.4 ±14.59142.7 ±13.32b SHR 空白对照组 10183.7 ±13.01165.3 ±7.48正常血压对照组 1094.2 ±14.6188.7 ±13.22 b

2.2 ELISA 法测各组大鼠血清中hs-CRP、IL-1β、TNF-a 的浓度

经全方组治疗的大鼠，血清中IL-1β 浓度低于其他治疗组，经单因素方差分析，F =10.051，P =0.001，P ＜0.05，有统计学意义，经两两比较后发现，全方组与正常血压对照组有的IL-1β 浓度有显著性差异(P ＜0.05);TNF-a 浓度低于其他治疗组，经单因素方差分析，F =3.569，P =0.017，P ＜0.05，有统计学意义，经两两比较后发现，全方组与正常血压对照组有的TNF-a 浓度有极显著性差异(P ＜0.01);hs-CRP 浓度低于其他治疗组和对照组，经单因素方差分析，F=2.381，P =0.071，P ＞0.05，无统计学意义。全方组在与普通组相比，有不同程度的显著性降低 hs-CRP、TNF-a 及 IL-1β 的表达(P ＜0.05，P ＜0.01)，见表2。

表2 各组大鼠血清中hs-CRP、TNF-a、IL-1β 的浓度(±s)

表2 各组大鼠血清中hs-CRP、TNF-a、IL-1β 的浓度(±s)

注:与普通组相比，aP ＜0.05，bP ＜0.01

组别nhs-CRP(ng/ml)TNF-a(ng/ml)IL-1β(pg/ml)全方组113.58 ×10 -4 ±0.095 ×10 -9 b77.81 ×10 -4 ±4.564 ×10 -9 b0.54 ×10 -4 ±0.023 ×10-12 a解毒组104.32 ×10 -4 ±0.076 ×10 -985.72 ×10 -4 ±4.479 ×10 -9 b0.45 ×10 -4 ±0.055 ×10 -12 a潜阳组74.08 ×10 -4 ±0.163 ×10 -9126.45 ×10 -4 ±11.049 ×10 -9 b0.49 ×10 -4 ±0.036 ×10 -12 b通络组104.40 ×10 -4 ±0.289 ×10 -9 a121.79 ×10 -4 ±2.650 ×10 -90.64 ×10 -4 ±0.047 ×10 -12沙坦组104.19 ×10 -4 ±0.142 ×10 -980.85 ×10 -4 ±4.481 ×10 -90.55 ×10 -4 ±0.011 ×10 -12列酮组104.24 ×10 -4 ±0.101 ×10 -993.42 ×10 -4 ±3.060 ×10 -9 b1.01 ×10 -4 ±0.192 ×10 -12 SHR 空白对照组104.40 ×10 -4 ±0.169 ×10 -9 a120.17 ×10 -4 ±11.410 ×10 -9 b0.91 ×10 -4 ±0.311 ×10 -12正常血压对照组104.07 ×10 -4 ±0.243 ×10 -954.62 ×10 -4 ±15.843 ×10 -90.38 ×10 -4 ±0.050 ×10-12

2.3 RT-PCR 法测PPAR-γ、TNF-a 及TLR4 的mRNA 在大鼠心肌细胞中的表达

经全方组治疗的大鼠，与SHR 空白对照组及正常血压对照组对比，可显著降低TNF-a 及TLR4 在大鼠心肌组织中的表达(P ＜0.05)，增加PPAR-γ 在大鼠心肌组织中的表达(P ＜0.05)。在计算TNF-a 时，经单因素方差分析，F=1.068，P=0.426，P ＜0.05，有统计学意义，经两两比较后发现，全方组与正常血压对照组有的TNF-a 浓度有极显著性差异(P ＜0.01);在计算TLR4 时，经单因素方差分析，F =2.157，P=0.096，P ＜0.05，有统计学意义，经两两比较后发现，全方组与正常血压对照组有的TLR4 浓度有显著性差异(P ＜0.05);在计算PPAR-γ 时，经单因素方差分析，F=1.339，P=0.296，P ＜0.05，有统计学意义，经两两比较后发现，全方组与正常血压对照组有的PPAR-γ浓度有极显著性差异(P ＜0.01);见表3，图1～3。

图1 各组药物对大鼠心肌细胞中PPAR-γmRNA表达的比较

图2 各组药物对大鼠心肌细胞中TNF-a mRNA表达的比较

图3 各组药物对大鼠心肌细胞中TRL4 mRNA表达的比较

表3 各组药物对大鼠心肌细胞中PPAR-γ、TNF-a、TLR4 的mRNA 表达的比较(±s)

表3 各组药物对大鼠心肌细胞中PPAR-γ、TNF-a、TLR4 的mRNA 表达的比较(±s)

注:与普通组组比，aP ＜0.05，bP ＜0.01

组别nPPAR-γ(u/ml)TNF-a(u/ml)TLR4(u/ml)全方组11122.38 ×10 -4 ±9.878 ×10 -4 b82.04 ×10 -4 ±13.751 ×10 -4 a123.99 ×10 -4 ±9.438 ×10-4 b解毒组1079.63 ×10 -4 ±6.609 ×10 -4 b121.59 ×10 -4 ±22.618 ×10 -4 b126.16 ×10 -4 ±25.352 ×10 -4 b潜阳组784.78 ×10 -4 ±5.186 ×10 -4 b89.04 ×10 -4 ±16.696 ×10 -4 b74.38 ×10 -4 ±4.993 ×10 -4 a通络组1069.00 ×10 -4 ±7.034 ×10 -4 b113.90 ×10 -4 ±28.187 ×10 -4 b99.68 ×10 -4 ±2.283 ×10 -4 b沙坦组1076.50 ×10 -4 ±1.432 ×10 -4 b157.92 ×10 -4 ±18.089 ×10 -4 b136.90 ×10 -4 ±8.216 ×10 -4 b列酮组1071.69 ×10 -4 ±7.072 ×10 -4 b107.69 ×10 -4 ±14.737 ×10 -4 b70.30 ×10 -4 ±6.168 ×10 -4 b SHR 空白对照组1056.98 ×10 -4 ±6.243 ×10 -4141.64 ×10 -4 ±15.708 ×10 -4 b123.04 ×10 -4 ±11.059 ×10 -4正常血压对照组1049.32 ×10 -4 ±8.756 ×10 -446.32 ×10 -4 ±4.209 ×10 -4 b102.81 ×10 -4 ±15.947 ×10-4

3 讨论

高血压病是危害人类健康的主要杀手，糖尿病、心脏病、脑卒中都与血压长期升高有密切关系［5］。研究发现，炎症因子在高血压的发生、发展及转归中占有重要的作用［6］。而各类炎症因子的上游基因TLR4 如何介导炎症反应的发生，现已成为研究热点。已有研究表明，TLRs 与心血管疾病发生与发展有着紧密的联系［7-8］。从TLRs 信号传导通路入手，找出其重要节点加以阻断，将成为控制炎症反应的重要手段，从而对由TLRs 信号通路激活导致的高血压、心肌肥厚等疾病进行有效的治疗。近年来对TLRs 信号转导通路的研究显示:NF-κB 是TLR4 信号转导MyD88 途径中重要的级联信号因子之一。TLR4/NF-κB 被激活后，各种激活诱导物(如细胞因子TNF-α，IL-1β)作用于NF-κB，使得其表达增加，导致IL-1β、TNF-α 及hs-CRP 等炎症因子表达增加，发生炎症反应，同时这些炎症因子再作用于NF-κB，形成一个炎症循环［9］。可以说，致炎症因子TNF-α、IL-1β 既是TLR4/NF-κB 信号通路活化的上游因素，又是TLR4/NF-κB 信号通路活化的产物，两者相互作用，互为因果，形成炎症因子网络，使得高血压病得以发生及发展。现已证实，吡格列酮作为人工合成的是噻唑烷二酮(TZD)药物，可通过抗炎作用逆转原发性高血压左心室肥厚，可在临床广泛应用于糖尿病合并高血压患者。这给今后临床在治疗高血压病提供了一个新的思路和选择。

基于现代高血压病的研究，各种机制导致的全身小动脉血管收缩为引起高血压的主要表现，中医理论认为高血压属络病［10-11］，属本虚标实，或虚实夹杂之病证。不同原因导致的脉络绌急(“阳亢”—络风内动)为高血压发病的基础和主要机制，与现代生活方式不良密切相关，饮食不节，醇甘厚味(咸能入血)，滋生“痰浊”、“瘀血”为主要致病因素和病理变化，痰瘀互结，络脉受损，气血运行受阻，致太过不及，“阳亢”而络风内动，而有“痰瘀阻络，脉络绌急”为主要致病机制。瘀血痰浊，郁腐成毒，热毒化风，日久导致“毒损心络”，从而导致心脏发生肥厚重塑及心力衰竭。潜阳解毒通络饮是基于“痰浊、血瘀、阳亢”的高血压病理变化和“痰瘀阻络、脉络绌急、毒损心络”的高血压心肌肥厚病理机制而设，显示出平稳的降压作用，与郭宇光［12］等研究结果基本相同。

本实验采用潜阳解毒通络饮对自发性高血压大鼠进行治疗观察，实验发现:(1)潜阳解毒通络饮能够有效降低原发性高血压大鼠(SHR)的血压，降压趋势与阳性对照组相类似，但无统计学意义(P ＞0.05)。(2)潜阳解毒通络饮能够有效抑制SHR 大鼠血清中IL-1β、TNF-α 及hs-CRP 炎症因子的表达(P ＜0.05)。提示潜阳解毒通络饮可以从炎症角度对高血压进行干预。(3)分子生物学实验结果显示，潜阳解毒通络饮能够显著增加PPAR-γ 在原发性高血压大鼠(SHR)心肌组织中的表达，同时抑制TLR4及TNF-α 在心肌组织中的表达(P ＜0.05)。中药干预原发性高血压大鼠(SHR)心肌组织中TLR4 及NF-κB 上游物质TNF-α 的基因表达明显降低，提示潜阳解毒通络饮抑制了炎症反应中TLR4 及TNF-α的转录与复制。

综上，实验证明中药潜阳解毒通络饮通过作用于PPAR-γ 途径介导抑制炎症因子表达，是其主要作用机制之一。其详细作用机制，尚待进一步研究。

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