陈通威，胡明明

·技术与方法·

降低人血白蛋白制品中PKA的方法初探

陈通威，胡明明

人血白蛋白临床主要用于治疗烧伤、失血引起的休克，防止低蛋白血症及肝硬化或肾病引起的水肿或腹水[1]。刘隽湘[2]认为人血白蛋白制品中存在两种毒性物质：一种是热原质，一种就是激肽释放酶原激活物（PKA）。PKA 是血浆因子 XII 被激活后释放出的 β-XIIa 肽段[3]。PKA 能激活激肽释放酶原（PK），使其转变为激肽释放酶（K），激肽释放酶再将高分子激肽原（HMWK）水解，释放出具有生物活性的激肽（BK）[4]。激肽对人体具有一定的副作用，它可引起心血管及外周血管扩张，肺毛细血管收缩，血压下降，局部疼痛；严重时引起水泡、呼吸加速等，其中最突出的临床表现就是引起血压的下降[2]。鉴于 PKA 的危害性，本文就人血白蛋白制品生产过程中如何降低 PKA 作了一些初步的探索。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料与试剂 健康人血浆，采自康宝生物长子单采血浆站。乙醇，药用，为新乡市先丰医药新材料有限公司产品；醋酸钠，药用，为台山市新宁制药有限公司产品；冰醋酸，药用，为四川金山制药有限公司产品。

1.1.2 设备与仪器 不锈钢筛网 200 目，自制。BAX-600血浆分离机购自重庆轻工业机械公司；GQ-142 离心机购自上海离心机研究所；Cuf-600 超滤机购自美国密理博公司；FYG-5000 反应罐购自浙江温兄阀业公司；1 m3巴氏灭活系统购自四川英德生物公司；TU1901 紫外-可见分光光度计购自北京普析通用仪器公司。

1.2 方法

1.2.1 人血白蛋白制品工艺流程如图 1 所示。

图1 人血白蛋白制品工艺流程简图

1.2.2 融浆阶段筛网处理 原料血浆中含有一定量的PKA，血浆中的纤维蛋白原在融浆过程中特别容易活化为纤维蛋白凝块，对 PKA 具有一定的吸附作用。在融浆过程中，我们对融化血浆使用 200 目不锈钢筛网过滤截留纤维蛋白凝块，以期达到截留 PKA 的目的。

1.2.3 组分 IV 沉淀的分离阶段工艺参数处理 人血白蛋白生产过程中，组分 IV 沉淀可以带走大量的 PKA。在组分 IV 沉淀分离阶段的工艺控制参数主要有温度、乙醇浓度、蛋白浓度、离子强度和 pH。我们对组分 I + II + III 上清液采用三种工艺分别生产一批人血白蛋白制品，观察制品中 PKA 的含量变化。工艺参数组合情况见表 1。

表 1 工艺参数组合情况

1.2.4 组分 V 沉淀分离阶段工艺处理 组分 V 沉淀的分离方法有两种，一种是离心法，一种是压滤法。我们对组分 IV 上清液用压滤法与离心法分离组分 V 沉淀，分别生产人血白蛋白制品，观察制品中的 PKA 含量变化。

1.2.5 病毒灭活阶段工艺处理 人血白蛋白的病毒灭活方法是巴氏灭活法，即对半成品进行 60 ℃ ，10 h 连续加热。加热可能灭活 PKA，人血白蛋白半成品进行巴氏灭活、巴氏灭活后以 60 ℃ 继续加热 2 h、巴氏灭活后以 62 ℃ 继续加热 2 h、巴氏灭活后以 63 ℃ 继续加热 2 h 处理，观察制品中 PKA 含量变化。

1.2.6 PKA 检测方法及其限度要求 采用显色底物法，用紫外-可见分光光度计在波长 405 nm 处测定供试品中激肽释放酶原激活物（PKA）含量[5]。依据《中国药典》2010 版要求，人血白蛋白制品中 PKA 含量应不高于 35 IU/ml[6]。

2 结果

2.1 融浆阶段筛网处理结果

经不锈钢筛网过滤前、后的血浆分别用相同工艺生产人血白蛋白并进行 3 次测定，结果无显著差异（P < 0.05），见表 2。

表 2 不锈钢筛网处理前后制品的 PKA 含量（IU/ml）

2.2 组分 IV 沉淀分离阶段处理结果

组分 IV 沉淀分离阶段采用三种工艺生产的 3 批人血白蛋白制品，每批测定 3 次，结果表明，随着工艺参数变化，PKA 的含量有明显变化（表 3）。

表 3 组分 IV 沉淀分离阶段不同工艺制品PKA 含量（IU/ml）

2.3 组分 V 沉淀分离阶段处理结果

用压滤法与离心法生产的 2 批人血白蛋白制品，每批测定 3 次，结果表明，离心法生产出来的制品 PKA 含量远远小于压滤法生产的制品（表 4）。

表 4 组分 V 沉淀分离阶段压滤法和离心法制品 PKA 含量（IU/ml）

2.4 病毒灭活阶段处理结果

巴氏灭活后保温处理结果表明，巴氏灭活后对制品继续以 60 ℃ 加热 2 h 未见 PKA 减少，而经 62 ℃ 和 63 ℃加热 2 h 后，PKA 下降明显（表 5）。

表 5 巴氏灭活后不同温度处理 2 h对白蛋白制品 PKA 的影响（IU/ml）

3 讨论

自采血分离血浆开始，由于凝血反应被启动，PKA 就随之产生。如使用未经硅化处理的玻璃器具，采血时不注意将血液与抗凝剂充分混合，在采血分浆过程中发生了凝血反应等原因都可以使原料血浆中的 PKA 含量大大增加。原料血浆在转运过程和在库保存期间容易造成反复冻融，Suontaka 等[7]报道，输血用血浆在 4 ℃ 保存期间发生冷激活，在冷激活中激肽释放酶样活性增加。在融浆过程中，纤维蛋白原特别容易活化为纤维蛋白变性而凝块，纤维蛋白凝块对 PKA 具有一定的吸附性。200 目筛网基本能够截留比较细小的纤维蛋白凝块。但采用 200 目筛网过滤原料血浆的方法，未能有效降低 PKA，可能与融浆时 PKA 在血浆中溶解度较大，而过滤的方式太过简单有一定的关系。

在组分 IV 沉淀分离阶段，降低反应温度，能减少蛋白质变性，改变反应的 pH 值和乙醇浓度，能对需要沉淀的蛋白质做出选择。工艺 3中反应温度降低，pH 值降低，乙醇浓度增高的处理方法，恰能使组分 IV 上清液中杂蛋白含量减少，白蛋白纯度明显提高，有利于白蛋白质量的提高，降低人血白蛋白制品中 PKA 的含量。其缺点是人血白蛋白的提取收率下降。组分 V 沉淀分离阶段，采取离心法分离能明显减少组分 V 沉淀中的杂蛋白，提高白蛋白纯度，从而降低人血白蛋白制品中 PKA 的含量。这与刘隽湘[2]报道的 Cohn 低温乙醇法参数变化对人血白蛋白提取的影响结果相符合。但是在采取不同的工艺参数或制作方法时，由于人血白蛋白的提取收率不同，企业为最大化地利用宝贵的血浆资源，应选择合适参数，在一定程度上减少白蛋白制品中PKA 的含量。

PKA 的前体是血浆因子 XII，60 ℃ 的高温可以灭活血浆因子 XII，从而造成 PKA 的失活。但是 PKA 对热有很高的稳定性，60 ℃，10 h 巴氏灭活还不能达到有效灭活PKA 的目的。制品经巴氏灭活，再进行 62 ℃ 或 63 ℃ 延长 2 h 加热后，能达到最大化的降低 PKA 的目的。这也提示我们，可以对人血白蛋白制品的病毒灭活工艺进行改进，使其同时起到灭活病毒和降低 PKA 的作用，从而达到提升人血白蛋白制品质量的目标。

[1] Wang Z, Zhao X, Lü MM, et al. Current status and trends in blood biologicais. Chin J Biotech, 2011, 27(5):730-746. (in Chinese)

王卓, 赵雄, 吕茂民, 等. 血液制品的现状与展望. 生物工程学报, 2011, 27(5):730-746.

[2] Liu JX. Blood transfusion therapy and blood products. Beijing: People's Medical Publishing House, 1996:57-196. (in Chinese)

刘隽湘. 输血疗法与血液制剂. 北京: 人民卫生出版社, 1996:57-196.

[3] Zhao KS, Jin LJ. Pathophysiology, Beijing: People's Military Medical Press, 1999. (in Chinese)

赵克森, 金丽娟. 病理生理学. 北京: 人民军医出版社, 1999.

[4] Pan CY, Shi D, Miao MY, et al. Progress in active metabolites of kallikrein-kinin system. Chem Life, 2008, 28(5):629-632. (in Chinese)

潘传涌, 时多, 缪明永, 等. 激肽系统活性产物. 生命的化学, 2008, 28(5):629-632.

[5] Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People's Republic of China. Volume 3, 2010. Beijing: China Medical Science Press, 2010: appendix 63-appendix 64. (in Chinese)

国家药典委员会. 中华人民共和国药典. 2010年版三部. 北京: 中国医药科技出版社, 2010:附录63-附录64.

[6] Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People's Republic of China. Volume 3, 2010. Beijing: China Medical Science Press, 2010:213. (in Chinese)

国家药典委员会. 中华人民共和国药典. 2010年版三部. 北京: 中国医药科技出版社, 2010:213.

[7] Suontaka AM, Silveira A, Söderström T, et al. Occurrence of cold activation of transfusion plasma during storage at +4 degrees C. Vox sang, 2005, 88(3):172-180.

·行业动态·

科学家进一步证实SARS病毒来源于中华菊头蝠

近期中国科学院武汉病毒研究所石正丽研究员带领的国际研究团队分离到一株与 SARS（Severe acute respiratory syndrome coronavirus）病毒高度同源的 SARS 样冠状病毒（SARS-like CoV），进一步证实中华菊头蝠是 SARS 病毒的源头。

SARS 冠状病毒是造成 2002 - 2003 年 SARS 暴发的病原，造成全球 8094 人感染和 774 人死亡的重大疫情。已有的流行病学证据和生物信息学分析显示，野生动物市场上的果子狸是 SARS 冠状病毒的直接来源。虽然在世界各地包括非洲、欧洲和中国的蝙蝠体内均发现与 SARS 病毒相似的 SARS 样冠状病毒，但这些病毒均不能利用人和果子狸的 ACE2（即人SARS 病毒受体）作为受体，不是 SARS 病毒的近亲。该团队分离的 SARS 样冠状病毒可以利用人、果子狸和中华菊头蝠ACE2 作为其功能受体，并且能感染人、猪、猴以及蝙蝠的多种细胞。这些实验结果为中华菊头蝠是 SARS 冠状病毒的自然宿主提供了更为直接的证据。这些最新结果发表在 2013 年国际著名学术期刊 Nature。这也是该团队继 2005 年在Science 上发表“蝙蝠是 SARS 样冠状病毒自然宿主”之后在此领域的又一项重大突破。该项目得到国家 973 和基金委重大项目等资助。

研究人员称，尽管蝙蝠携带多种病毒，但这些蝙蝠病毒传播到人的机会并不多。蝙蝠在自然生态中有很重要的作用，它们能传播花粉，是害虫的天敌，从不主动攻击人类。保护蝙蝠等野生动物的生存环境是远离野生动物病原感染的最好方式。

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2013.06.014

046011 长治，山西康宝生物制品股份有限公司

陈通威，Email：ctw001@126.com

2013-08-26