张培，李昕，刘芸，刘晔玮，骆姗，邸多隆，唐运昌

1(兰州大学公共卫生学院营养与食品卫生研究所，甘肃兰州，730000)2(中国科学院兰州化学物理研究所中科院西北特色植物资源化学重点实验室和甘肃省天然药物重点实验室，甘肃兰州，730000)

浆水是我国西北地区极具特色的发酵食品，一般是将原料(芹菜或苦苦菜等)先焯水后，再放入热水中，用老浆水为引子，再加入面汤直至发酵成熟，汤汁略呈乳白色，口味酸醇清香，多在夏季酿制。浆水具有减肥、开胃、健身等功效［1－2］。

目前国内对于浆水的研究主要是浆水中微生物的分离鉴定［3－5］，而对其中营养物质的研究较少。浆水富含有机酸，其有机酸的含量和种类维持浆水的酸碱平衡，影响浆水的口感及生物稳定性。适量的有机酸能促进食欲，帮助消化，利于人体健康［6－7］。

高效液相色谱法分析有机酸简单快速，可同时测定多种有机酸［8－9］，近年来不断有文献报道利用高效液相色谱法测定发酵食品中有机酸的方法［10－12］。本试验采用HPLC法，通过优化分析条件，建立了浆水中有机酸含量的分析方法。

1 材料与方法

1.1 样品

兰州市售浆水。

1.2 主要试剂

甲醇(色谱纯)，山东禹王集团;KH2PO4(AR)，西陇化工厂;超纯水，实验室自制;H3PO4(AR)，天津欧博凯化工;酒石酸(AR)，上海圣宇化工;乙酸(AR)，烟台双双化工;乳酸(AR)，天津光复精细化工;富马酸(AR)，郑州盛源化工。

1.3 仪器及设备

Agilent 1200高效液相色谱仪系统(包括G1311A四元梯度泵、G1315B DAD二极管阵列检测器、手动进样器和Agilent Chemstation工作站);Agilent ZORBAX SB-AQ 色谱柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，大连依利特C18色谱柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);高速离心机，上海安亭科学仪器;高压抽滤机，奥特赛恩斯公司。

1.4 实验方法

1.4.1 标准品溶液和样品溶液的制备

分别精密称取一定量酒石酸、乳酸、乙酸、富马酸，用双蒸水配制成标准溶液;精密量取一定量各标准溶液混合定容后，得到有机酸标准工作溶液，浓度分别为酒石酸0.4 mg/mL，乳酸6 mg/mL，乙酸1 mg/mL，富马酸1 ×10－3mg/mL。

取适量浆水在8 000 r/min下离心10 min，取上清液备用。进样前溶液用0.45 μm微孔滤膜过滤。

1.4.2 色谱条件

色谱柱:Agilent ZORBAX SB-AQ柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);检测波长:210 nm;流动相:甲醇∶0.01 mol/L KH2PO4溶液(体积比 0.5∶99.5，KH2PO4溶液pH=2.0);流速:0.6 mL/min;柱温:30℃;进样量:20 μL。在优选的色谱条件下，将1.4.1项下制备的标准品溶液和样品溶液分别进样分析(见图1)。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 检测波长的选择

在200～600 nm对各有机酸标准品的光谱吸收进行扫描，结果显示，λ=210 nm时，各有机酸都有较大吸收峰，所以选择210 nm为检测波长。

图1 标准品和样品的HPLC色谱图Fig.1 The chromatogram of standard substance and sample

2.1.2 色谱柱的选择

选用Agilent ZORBAX SB-AQ色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)和大连依利特C18色谱柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，对样品在2种色谱柱上的不同色谱行为进行了比较。结果显示，采用C18色谱柱，在不同比例甲醇-KH2PO4溶液、不同 pH值不同浓度的KH2PO4溶液作为流动相时样品中各有机酸均很难完全分离(见图2)。而采用AgilentZORBAX SB-AQ色谱柱，在一定的条件下样品中各有机酸分离结果较好(见图1B)，故选用AgilentZORBAX SB-AQ柱。

2.1.3 缓冲溶液浓度的选择

精密称取一定量的KH2PO4，分别配制成浓度为0.005 mol/L，0.01 mol/L，0.02 mol/L 的缓冲溶液，考察缓冲液浓度对样品中各有机酸分离效果的影响。结果表明，当KH2PO4溶液浓度为0.01 mol/L时，各有机酸分离效果较好(见图1B、图3)。

图2 C18色谱柱样品色谱图Fig.2 The sample chromatogram of C18column

图3 浓度为0.005 mol/L，0.02 mol/L的KH2PO4缓冲溶液色谱图Fig.3 The chromatogram of KH2PO4buffer solution concentration at 0.005 mol/L and 0.02 mol/L

2.1.4 pH值的选择

以0.01 mol/L KH2PO4溶液作流动相，用H3PO4调节流动相pH值分别为4.0、3.0和2.0，考察流动相pH值对样品中有机酸分离的影响。结果表明，当pH=2时，各有机酸分离效果较好(见图1B、图4)。

2.2 方法学验证

2.2.1 线性方程、线性范围和检出限

配制一系列不同浓度的有机酸标准品溶液，按1.4.2色谱条件分析，以被检测物的峰面积为纵坐标(Y)，标准品溶液浓度为横坐标(X)进行线性回归;检出限以信噪比(S/N)大于3时的检测浓度计算。4种有机酸的线性方程、相关系数(R2)和检出限见表1。从表1可以看出，在酒石酸、乳酸、乙酸、富马酸的浓度分别为0.003～0.1 mg/mL，0.48～24 mg/mL，0.02～0.9 mg/mL，0.001～0.07 mg/mL范围内，4种有机酸呈现良好的线性关系。

图4 pH=3和pH=4样品的色谱图Fig.4 The chromatogram of sample at pH=3 and pH=4

表1 4种有机酸的回归方程、相关系数、线性范围与检出限(n=3)Table 1 The linear equation，related coefficient，range of linearity and detection limit of the four organic acids(n=3)

2.2.2 方法精密度考察

按1.4.1条件处理样品后，按1.4.2色谱条件连续测定5次，考察日内精密度;连续进样3 d，考察日间精密度。结果见表2。从表2可以看出，4种有机酸的日内精密度的RSD%小于2%，日间精密度的RSD%小于5%，由此表明该液相色谱检测方法精密度良好。

表2 4种有机酸的精密度考察Table 2 The relative standard deviations investigation of the four organic acids

2.2.3 回收率考察

精确量取样品适量，在其中精确加入标准品混合溶液，按1.4.2色谱条件进样分析，回收率结果见表3。回收率实验的结果显示该样品方法可以满足分析的要求。

表3 回收率考察(n=5)Table 3 The investigation of the recoveries(n=5)

2.3 样品测定

精确量取样品适量，按1.4.1条件处理样品后，按1.4.2色谱条件测定样品中4种有机酸含量，结果分别为:酒石酸 0.048 2 mg/mL;乳酸 4.912 5 mg/mL;乙酸0.275 0 mg/mL;富马酸0.001 7 mg/mL(见表3)，表明浆水中有机酸以乳酸含量明显高于其他3种有机酸的含量为特征。

3 讨论

(1)建立了浆水中酒石酸、乳酸、乙酸、富马酸含量的HPLC测定方法。结果表明，该方法简单、快速、可靠。

(2)本试验曾使用依利特C18柱分离浆水中的有机酸，发现只有当甲醇∶0.01 mol/L KH2PO4(v∶v=0.5∶99.5)时各有机酸分离效果较好，但是流动相中水的比例大于80%时，会影响C18色谱柱的使用寿命。有文献报道［13］，C18色谱柱不适用于分离多种有机酸。ZORBAX SB-AQ柱通过对传统的C18柱改性，具有亲水性的表面，用于浆水中有机酸含量的测定得到了理想的结果。

(3)许多缓冲溶液在210 nm处都有吸收，而磷酸缓冲液在210 nm处几乎无吸收，可作为有机酸测定的流动相，故本试验选择KH2PO4作为缓冲液。缓冲溶液浓度越高，酸的存在形式越稳定，但当缓冲溶液的浓度过高时，离子强度增大，对组分分离不利，同时影响色谱柱的寿命，增加了流动相的本底吸收，降低了测定的灵敏度［14］。本试验分别选择缓冲液浓度为0.005 mol/L，0.01 mol/L，0.02 mol/L 考察对样品分离效果的影响，当缓冲液浓度为0.005 mol/L时，乳酸出现前展现象，当缓冲液浓度为0.02 mol/L时，各有机酸分离效果和浓度为0.01 mol/L时相似，但高浓度磷酸盐会影响色谱柱寿命，最终确定KH2PO4浓度为0.01 mol/L。

(4)通过调节流动相的pH值可抑制解离增加保留［15］。本试验用 H3PO4调节流动相 pH值分别为4.0、3.0和2.0，当pH=3时乳酸出现前展现象且未达到基线分离，pH=4时乳酸的峰和前一个未知酸峰未完全分离，出现遮掩现象，当pH=2各有机酸的分离效果较好。

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