刘永涛，艾晓辉，索纹纹，余少梅，陈建武

(1．中国水产科学研究院长江水产研究所农业部淡水鱼类种质监督检验测试中心，湖北武汉430223;2．中国水产科学研究院淡水研究中心，江苏无锡214081;3．华中农业大学水产学院，湖北武汉430070)

呋喃西林(nitrofurazone，NFZ)属硝基呋喃类抗菌药物，由于其在防治畜禽和水产动物的细菌和真菌等引起的疾病方面有较好效果曾被广泛应用于畜禽、水产养殖业中．呋喃西林进入动物体内后被迅速代谢，主要代谢物为氨基脲(semicarbazide，SEM)．呋喃西林及其代谢物SEM具有致癌、致突变作用［1－3］，欧盟、日本和我国已禁止其使用［4］，但由于呋喃西林价格便宜、疗效好，仍有养殖单位在使用该药．呋喃西林代谢物SEM在动物体内可与蛋白质紧密结合，残留期较长，因此，目前对于动物体内呋喃西林使用的监管主要是通过检测其代谢物SEM．目前，关于呋喃西林代谢物SEM在水产动物体内代谢与残留的报道较少，仅有关于大菱鲆［4］、中华绒螯蟹［5］、螯虾［6］等的报道．斑点叉尾鮰(Ietalurus punetaus)是我国从美国引进的淡水养殖品种，在我国大量养殖，并且每年出口量较大．目前，呋喃西林代谢物SEM在斑点叉尾鮰体内分布及消除规律的研究还未见报道．本研究首次以斑点叉尾鮰苗种为研究对象，探索呋喃西林代谢物SEM在斑点叉尾鮰各组织中的分布与消除规律，为加强该药物管理和监督非法使用提供依据．

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 试验动物 健康斑点叉尾鮰由湖北省仙桃市水产局提供，平均质量为(92．7±24．6)g．试验前在池塘的网箱(1 m×2 m×1．5 m)内暂养一周．试验池长37．1 m，宽18 m，平均水深1．1 m．试验期间(2011年5月23日至2011年8月20日)每天上午8点和下午18点投喂斑点叉尾鮰饲料，并记录水温．试验期间平均水温为28℃，池塘水体pH 7．5－8．0．试验结束时，斑点叉尾鮰的体重为(186±45．3)g．

1．1．2 仪器设备 高效液相色谱－串联质谱(SURYEYOR MS PUMP PLUS，SURYEYOR AUTOSAMPLER PLUS，Thermo TSQ QUANTUM ACESS MAX，Thermo LCquan 2．6数据采集处理软件);自动高速冷冻离心机(HITACHI 20PR-520，日本);Mettler-TOLEDO AE-240型精密电子天平(梅特勒—托利多公司);FS-1高速匀浆机(华普达教学仪器有限公司);调速混匀器(上海康华生化仪器制造厂);氮吹仪(AOSHENG，杭州奥盛仪器有限公司)．

1．1．3 药品和试剂 呋喃西林代谢物氨基脲(SEM)标准品(纯度 ＞93．5%，Dr．Ehrenstorfer GmbH);SEM-13C15-N2标准品(纯度＞99%，德国wegita)，呋喃西林原粉(纯度＞90．1%，济南金达药化有限公司);甲醇(色谱纯，美国J．T．Baker);LC-MS water(美国，CNW);乙酸铵(分析纯，美国J．T．Baker)，二硝基苯甲醛(分析纯，北京恒业中远化工有限公司)．

1．2 方法

1．2．1 色谱分析条件 色谱柱:Hypersil Gold C18(100 mm ×2．1 mm ×3 μm)反相色谱柱;柱温:30℃;流速 0．2 mL·min－1;进样量 20．0 μL．梯度洗脱条件(表1):A相为甲醇，B相为5 mmol·L－1乙酸铵溶液．

1．2．2 质谱分析条件 离子化模式:加热大气压电喷雾离子源(HESI)，正离子模式;检测方式采用选择反应监测(SRM)模式;喷雾电压:3000 V;源内解离电压0 V;鞘气压力40 arb;辅助气压力20 arb;碰撞气及压力:氩气，1．5 m Torr;离子传输毛细管温度:350 ℃;Q1 PW 0．7，Q3 PW 0．7 ．母离子、定性离子对、定量离子对和碰撞能量见表2．

1．2．3 试验设计与采样 药液的配制:称取1．8 g呋喃西林原粉，溶于90 L水中，配制成20 mg·L－1呋喃西林溶液，置于125 L塑料箱中．

表1 流动相梯度洗脱程序Table 1 The mobile phase gradient elution program

表2 呋喃西林代谢物及其同位素内标质谱条件1)Table 2 Spectometric parameters of SEM and SEM-13C15-N2

斑点叉尾鮰下塘前，采用 20 mg·L－1呋喃西林浸泡 15 min，于给药后 0．25、0．5、1．0、2．0、4．0、6．0、8．0、12、24、48、96、192、288、384、480、720、1080、1440、2160、2880 h 尾静脉取血液、肌肉、皮肤、肝脏和肾脏等组织，置－20℃冰箱避光保存，待测定．每个时间点各取5尾鱼，作为5个平行样品分别处理测定．对照组为不用呋喃西林浸泡，养殖在同一池塘的不同网箱中的斑点叉尾鮰，定期采集样品进行分析．

1．2．4 样品前处理 血液、肌肉、肝脏、肾脏和皮肤样品的处理，按照参考文献［7］进行，略有改动．将冷冻保存的血液、肌肉、皮肤、肝脏和肾脏样品室温下自然解冻，取血液1 mL，皮肤1．0 g，肌肉2．0 g，肝脏和肾脏根据样品量称取并记录称取量，其余按照标准方法执行．

1．2．5 标准曲线的制备及回收率与精密度测定 标准曲线的制备:配制含SEM浓度为1、2、5、10、20 ng·mL－1，含5 ng·mL－1内标的标准溶液的低浓度标准溶液系列，配制含 SEM 浓度为 50、100、200、500、1000 ng·mL－1，含5 ng·mL－1内标的标准溶液的高浓度标准溶液系列，作HPLC/MS/MS分析，以测得的SEM与SEM-13C15-N2面积的比值X为横坐标，SEM浓度Y为纵坐标，绘制标准曲线，求出回归方程和相关系数．用空白组织制成低质量浓度药物的含药组织，经预处理后测定，将引起3倍基线噪音的药物的质量浓度定义为最低检测限．

回收率与精密度测定:回收率/%=Cr/C0×100，其中Cr为用空白血液、肌肉肝脏、皮肤、肾脏组织中加入一定量的SEM已知标准溶液，再按样品预处理方法进样后，测定SEM的质量浓度;C0为加入一定量的SEM已知标准溶液．在5种空白组织中分别添加4个浓度水平的标准溶液，使组织中质量浓度分别为1．0、20．0、50．0 和 200．0 μg·kg－1，血液为 1．0、10．0、50．0、100．0 和 200．0 μg·L－1．每个浓度的样品，日内做5个重复，一周内重复做5次，计算日内及日间精密度．

1．2．6 数据处理 标准曲线，药物经时曲线图，消除方程及休药期计算和回归图，采用Microsoft Excel 2003，进行计算和绘制．消除方程采用C=C0×e－kt，C表示药物浓度，C0为残留消除对数曲线的截距(μg·kg－1)，k表示消除速率常数．

2 结果与分析

2．1 标准曲线方程与相关系数

在1．0 －20．0 ng·mL－1和50．0 －1000．0 ng·mL－1范围内，SEM 线性关系良好，低浓度线性方程为 Y=0．0234054+0．130627X;高浓度线性方程为 Y=0．0801631+1．3252417X ，相关指数均大于 R2=0．9988．

2．2 方法检测限、回收率与精密度

本试验条件下，血液中SEM方法检测限为0．5 μg·L－1，肌肉、肝脏、肾脏和皮肤组织中SEM方法检测限均为0．5 μg·kg－1．各组织中5个质量浓度加标水平的SEM平均回收率为96．32% －108．65%，测得的日内精密度与日间精密度均小于10%．

2．3 SEM在斑点叉尾鮰血液中的浓度

将测到的SEM的峰面积分别与其氘代同位素内标峰面的比值，代入标准曲线方程，可以求出SEM在斑点叉尾鮰血液中的浓度(表3)．由表3可以看出，SEM峰浓度分别出现在1 h，浓度为(37．5±7．45)ng·mL－1，1440 h(60 d)的浓度为(0．57 ±0．25)ng·mL－1，2160 和2880 h 时，均未检测到 SEM．

表3 呋喃西林(20 mg·L－1)浸泡后SEM在斑点叉尾鮰血液中的浓度1)Table 3 The concentrations of SEM in channel catfish blood after 20 mg·L－1nitrofuranzone bath

2．4 SEM 在斑点叉尾鮰组织中分布和消除规律

由表4 可知，2 h 时，SEM 在斑点叉尾鮰肌肉中达到峰值(33．3 ±8．25)μg·kg－1，480 h(20 d)的浓度为(1．17 ±0．80)μg·kg－1，1440 h(60 d)的浓度为(0．28 ±0．03)μg·kg－1，90 d 的肌肉中未检出 SEM．SEM在斑点叉尾鮰皮肤中 2 h达到峰浓度(168．20 ±43．47)μg·kg－1，1080 h(45 d)的浓度为(8．75 ±0．52)μg·kg－1，1440 h(60 d)的浓度为(0．83 ±0．24)μg·kg－1，90 d 时皮肤中未检出 SEM．在斑点叉尾鮰肝脏中，SEM 在 2 h 达到峰浓度(105．00 ±48．40)μg·kg－1，1080 h(45 d)的浓度为(1．00±0．08)μg·kg－1，60 d 的肝脏中未检出 SEM．斑点叉尾鮰肾脏中，SEM 在 1 h 达到峰浓度为(383．30 ±89．20)μg·kg－1，1080 h(45 d)的浓度为(5．47 ±1．26)μg·kg－1，60 d 时，肾脏中未检出 SEM．

表4 呋喃西林(20 mg·L－1)浸泡后SEM在斑点叉尾鮰组织中的浓度1)Table 4 The concentrations of SEM in channel catfish tissues after 20 mg·L－1nitrofuranzone bath

在4种组织中，SEM的消除半衰期从大到小依次为:血液＞皮肤＞肌肉＞肾脏＞肝脏(表5)．

表5 SEM在斑点叉尾鮰各组织中消除曲线方程及相关指数Table 5 The equation of elimination curve and correlation indexes of SEM in channel catfish after water bath of 20 mg·L－1nitrofuranzone

3 讨论

目前，导致呋喃西林代谢物SEM在动物食品中的残留原因，不仅与使用呋喃西林有关，还可能因为包装和加工过程中其他污染造成［4］．而对于鲜活水产品而言，除甲壳类动物的甲壳和与甲壳相连的上皮层中自然产生的氨基脲［8］外，其它水产动物尚未有自身能产生氨基脲的报道．本研究对试验环境如水体和底泥以及所用斑点叉尾鮰进行了本底筛查，均不含SEM．因此，SEM作为呋喃西林在斑点叉尾鮰体内残留的标示物是可行的．本试验采用生产实践中所用的给药方式和给药剂量，并且在网箱养殖条件下，探索呋喃西林代谢物SEM在斑点叉尾鮰各组织分布及其代谢规律，研究结果更接近于实际情况．

本研究表明，呋喃西林代谢物SEM在斑点叉尾鮰血液及其它组织中的起始浓度水平为:肾脏＞皮肤＞肝脏＞血液＞肌肉．谭志军等［4］研究表明，在单药给药方式下，呋喃西林代谢物SEM在大菱鲆组织中的起始残留浓度为:肝脏＞血液＞肌肉．蒋原等［6］研究SEM在克氏原螯虾组织中的起始浓度为:鳃＞肝胰脏＞肌肉，SEM在水产动物肌肉组织中的残留浓度较其它组织低．谭志军等［4］采用呋喃西林药浴质量分数为20×10－12，每天静水药浴2次，上午和下午各1次，每次约3 h，共持续5 d，SEM在大菱鲆血液、肝脏和肌肉中最高累积浓度分别为 129．94、218．81 和 111．66 μg·kg－1;而本试验采用 20 mg·L－1的呋喃西林浸泡斑点叉尾鮰15 min，SEM在血液和肾脏中最高累积浓度出现在1 h，浓度为(37．50±7．45)ng·mL－1;SEM在斑点叉尾鮰肌肉、皮肤和肝脏最高累积浓度均出现在 2 h，浓度分别为(33．30±8．25)、(168．20 ±43．47)和(105．00 ±48．4)μg·kg－1．因此，SEM 在这 2 种鱼体内的富集能力较弱，而各组织中SEM富集能力最差的是肌肉组织．480 h(20 d)时，肌肉中SEM浓度是其最小允许值1 μg·kg－1(欧盟2003年181号决议)的1．1倍，血液、皮肤、肝脏和肾脏中SEM在1080 h(45 d)时，分别是最小允许限1 μg·kg－1的1．17、8．75、1．0 和5．47 倍．在本试验条件下90 d 后，SEM 在斑点叉尾鮰各组织中均未被检出，而有研究表明SEM在大菱鲆体内185 d后，仍有检出且检出值高于1 μg·kg－1，SEM在血液和各组织中消除半衰期为:血液(11．11 d)＞ 皮肤(9．02 d)＞肌肉(8．25 d)＞肾脏(7．40 d)＞ 肝脏(6．71 d)，而SEM 在大菱鲆肌肉、血液和肝脏组织中的半衰期分别为34．1、24．6和20．3 d，两者差异较大，可能与鱼体生理生化特性相关．整个实验期间的平均水温为28℃，在此养殖条件下，在斑点叉尾鮰苗种各组织中，消除SEM至少需要2520℃·d．

［1］KELLY B D，HENEGHAN M A，BENNANI F，et al．Nitrofurantoin-induced hepatotoxicity mediated by CD8+T cells［J］．A-merican J Gastroenterology，1998，93(5):819 －821．

［2］BOCK C，GOWIK P，STACHEL C．Matrix-comprehensive in house validation and robustness check of a confirmatory method for the determination of four nitrofuran metabolites in poultry muscle and shrimp by LC-MS/MS［J］．J Chromatography B，2007，856(1 －2):178 －189．

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［4］谭志军，翟毓秀，冷凯良，等．呋喃西林和呋喃唑酮代谢物在大菱鲆组织中的消除规律［J］．中山大学学报:自然科学版，2008，47(S):63 －69．

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［6］蒋原．HPLC/MS/MS测定兽药残留及其在螯虾中消除规律的研究［D］．南京:南京农业大学，2005．

［7］中华人民共和国农业部．GB/T 20752－2006水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定液相色谱—串联质谱法［S］．北京:中国农业出版社，2006．

［8］MCCRACKEN R，HANNA B，ENNIS D，et al．The occurrence of semicarbazide in the meat and shell of Bangladeshi freshwater shrimp［J］．Food Chemistry，2011，136(3 －4):1562 －1567．