黄秀萍，郭文硕，，冯丽贞，，叶小真，谢婉凤

(1．福建农林大学林学院;2．福建农林大学森林保护研究所，福建福州350002)

毒素是指由植物病原菌代谢产生的、在生理浓度范围内即可干扰植物正常生理功能、对植物有毒害作用的非酶类化合物［1－3］．致病菌毒素作用于寄主植物后寄主体内各种保护酶体系发生变化．于丽娜等［4］研究发现用冬枣黑疔病病原菌毒素处理冬枣果皮组织，丙二醛(MDA)含量随毒素含量的提高而升高，过氧化氢酶(CAT)活性总体下降，过氧化物酶(POD)活性中期呈下降趋势．张晓刚等［5］用杨树溃疡病毒素处理不同品种杨树枝条，结果表明叶片电导率、过氧化氢酶、多酚氧化酶和脯氨酸这4个指标均能很好地反映杨树不同品种的抗病性．目前，有关毒素的报道主要集中在小麦、水稻、玉米、大豆、辣椒、白菜等农作物上［6－10］，而林业上的研究较少．

雷公藤(Tripterygium wilfordii)属卫矛科(Celastraceae)雷公藤属(Tripterygium spp．)攀援植物，其根、茎、叶都能入药．现代临床及药理学研究表明，雷公藤具有显著的抗炎、抗肿瘤、调节体液免疫等功能，是临床治疗风湿或类风湿性关节炎的常用中药［11－13］．福木假尾孢(Pseudocercospora elaeodendri)是引起雷公藤角斑病的病原菌，该病害会造成雷公藤叶片大量提前脱落，形成弱株、死株，使雷公藤根、叶产量下降［14］．由于雷公藤野生资源储量匮乏，近年来我省大面积种植雷公藤．大面积人工纯林的种植使得雷公藤角斑病发生严重，给农户造成了巨大的经济损失．目前对该病原菌的研究主要集中在雷公藤角斑病菌生物学特性［14－17］．大量室内试验证明，人工培养下假尾孢菌不易产生分生孢子［14，18］，所以利用其繁殖体防治雷公藤角斑病有很大的局限性．鉴于此，本文用不同浓度的假尾孢菌毒素处理雷公藤，分析超氧化物歧化酶(SOD)、POD、CAT、MDA、苯丙氨酸解氨酶(PAL)等抗病指标的变化，揭示毒素对雷公藤角斑病抗性机理，为雷公藤角斑病的防治、抗病品种的选育和生物农药的研发奠定基础．

1 材料与方法

1．1 供试材料

1．1．1 菌株 福木假尾孢菌株(P．elaeodendri)由福建农林大学森林保护研究所提供．

1．1．2 材料 1 a生雷公藤苗木由三明泰宁县林业局提供，种植于福建农林大学森林保护研究所试验地．

1．2 方法

1．2．1 培养基配方 PSA培养基:200 g马铃薯+20 g蔗糖+20 g琼脂+1000 mL纯水．

改进的查彼培养基:2 g NaNO3+1 g K2HPO4+0．5 g KCl+0．5 g MgSO4·7H2O+0．01 g FeSO4+30 g蔗糖+1000 mL纯水+10 g蛋白胨．

1．2．2 培养液的制备 将雷公藤角斑病菌接到PSA培养基上，29℃下培养15 d．用直径为6 mm的圆形打孔器在菌落边缘打菌丝块，接种到盛有150 mL改进的查彼培养基的三角瓶中，每瓶接7个菌饼．置于温度为29℃、转速120 r·min－1的摇床中暗培养25 d．将培养的菌液先用双层纱布滤去菌丝，经布氏漏斗(含2层滤纸)抽滤，滤液于低温冷冻离心(5000 r·min－1)18 min，上清液即为无菌丝的含毒滤液．在45℃下低压旋转蒸发到原体积的1/10，于5000 r·min－1下离心18 min，取上清液，即为培养液．

1．2．3 毒素的处理 将培养液分别稀释为原液的10%、20%、40%、100%4个浓度，将雷公藤幼梢分别插入装有30 mL毒素液的瓶中，使幼梢基部约3 cm浸在毒素液中，每瓶放置20枝幼梢，3次重复，并以灭菌的培养基滤液作为对照(CK)．处理的枝条置于室温下观察，分别在处理0、12、24、36、48 h后取样，4℃保存备用．

1．2．4 酶液活性的测定 SOD、POD、CAT、MDA和PAL酶液的提取及活性测定均参考李合生［19］的方法．

图1 不同浓度毒素对SOD活性的影响Fig．1 Effect of toxin concentration on SOD activity

2 结果与分析

2．1 不同浓度毒素对雷公藤叶片SOD活性的影

采用不同浓度毒素对雷公藤叶片处理0－12 h后SOD活性都显著提高;用20%、40%、100%浓度毒素对雷公藤叶片处理24 h后SOD活性达到了峰值，且用100%浓度毒素对雷公藤叶片处理后SOD活性明显高于其它浓度处理;而10%浓度毒素处理和对照在36 h后SOD活性才达到峰值．各种浓度处理的SOD活性都明显高于对照．毒素处理48 h使雷公藤叶片SOD含量大大升高，从而提高了雷公藤的抗病性．不同浓度毒素处理雷公藤后SOD活性的变化均呈先上升后下降的趋势(图1)，这与李清海等［20］的研究结果一致．

2．2 不同浓度毒素对雷公藤叶片POD活性的影响

用不同浓度毒素处理雷公藤，叶片内POD活性均随处理时间的延长而升高，且都高于对照(图2)．用100%浓度毒素处理后POD活性呈先上升后下降的趋势;用其它浓度毒素处理后POD活性则呈先上升再下降又上升的趋势．用100% 浓度毒素处理后POD活性在第36小时出现峰值，随后开始逐渐下降．而用10%、20%、40%浓度毒素处理后POD活性在第48小时仍处于上升趋势，其中40%浓度毒素处理后POD活性比对照提高25%．研究表明雷公藤受毒素侵染后在一定时间内是通过大幅度提高POD活性来抵御毒素毒害的．从毒素侵染后POD活性的变化趋势(图2)可以看出，处理组POD活性都高于对照，表明毒素促使雷公藤叶片POD增量表达，从而提高了雷公藤的抗病性．

2．3 不同浓度毒素对雷公藤叶片CAT活性的影响

用不同浓度毒素处理雷公藤，叶片内CAT活性随时间的延长呈先上升后降低再上升的趋势，不同处理的酶活性峰值都出现在第24小时(图3)．在前期(0－12 h)，只有10%浓度毒素处理和对照的CAT活性上升;12－24 h CAT活性都呈上升趋势;24－36 h CAT活性又都处于下降趋势;36－48 h CAT活性又开始上升．总体上看，对照的CAT酶活性基本上都明显高于处理组，表明P．elaeodendri毒素对CAT的抑制作用比较强．

2．4 不同浓度毒素对雷公藤叶片MDA活性的影响

从图4可以看出，用不同浓度毒素处理雷公藤，0－36 h叶片中MDA含量一直处于上升趋势;第36小时MDA含量达到峰值;36－48 h MDA含量急剧下降．MDA含量在第36小时达到最大值，膜脂过氧化作用最强．这是由于SOD等抗氧化酶活性下降过快，使H2O2、O－2不断积累，导致膜脂过氧化作用增强．36 h后除了100%浓度毒素处理外，其它浓度毒素处理的MDA含量都明显低于对照，说明防御酶活性增强，清除氧自由基能力增强，导致膜脂抗氧化作用减弱，从而保护了细胞膜．100%浓度毒素处理MDA含量处于最高水平，说明高浓度毒素对细胞的毒害作用超过雷公藤解毒能力．

2．5 不同浓度毒素对雷公藤叶片PAL活性的影响

图5 不同浓度毒素对PAL活性的影响Fig．5 Effect of toxin concentration on PAL activity

从图5可看出，用不同浓度毒素处理雷公藤，0－12 h PAL活性逐渐降低，且都低于对照;在第12小时PAL活性达到最小值;随后PAL活性开始上升;在第24小时，20%、40%和100%3个浓度毒素处理的PAL活性达到峰值，且明显高于对照;24 h后PAL活性都开始有下降的趋势;36 h后PAL活性又开始逐渐上升，低浓度(10%、20%和40%)毒素处理的PAL活性急剧回升且高于对照，而100%浓度毒素处理的PAL活性则呈下降趋势;36－48 h用10%、20%、40%3个浓度处理的PAL活性持续上升且高于对照，而100%处理的PAL活性有下降的趋势，且明显低于对照．表明低浓度毒素处理可以提高叶片内部PAL活性，诱导雷公藤对该毒素的抗性，这与胡运高等［21］研究结果一致．

3 小结与讨论

植物在逆境下产生大量活性氧，活性氧可以导致蛋白质、膜脂、DNA及其它组分严重损伤，SOD能将转化为毒性较小的H2O2和O2，而POD、CAT又可进一步将H2O2转化成无害的H2O和O2，从而对生物体有保护作用［22－23］．MDA是膜脂过氧化作用的最终产物，其含量升高使细胞保护酶的活性受到抑制，并降低了抗氧化物含量．MDA含量的动态变化体现植物对逆境条件反应的强弱，可作为植物抗病性鉴定的生理指标［24］．PAL是植物体内连接初级代谢和苯丙烷代谢途径的关键酶和限速酶，在植物的次生代谢和抗病代谢中具有极其重要的作用，植物体内多种次生酚类化合物、木质、类黄酮植保素等抗菌物质的合成与其活性高低密切相关［25］．研究［26］表明，保护酶活性的升高能增强植物的抗病能力．

用福木假尾孢菌毒素处理雷公藤幼梢后，雷公藤受到毒素的胁迫，诱导自身产生系统抗性，SOD、POD、CAT、PAL等保护酶系统酶活性(除100%浓度毒素处理外)均表现为先上升后下降再上升的趋势，而膜脂过氧化作用的最终产物MDA在0－36 h内上升，但在36－48 h开始下降．表明雷公藤受毒素侵染后能够应激作出反应，促使雷公藤体内保护酶增量表达，减弱膜脂过氧化作用，提高了雷公藤的抗病性，从而对植物体起到保护作用．高浓度毒素处理后酶活性达到峰值后迅速下降并低于对照，其对活性氧的解毒能力已开始丧失，毒素对雷公藤的伤害大于雷公藤的防御能力，表现为48 h后叶片枯萎．综上所述，不同浓度福木假尾孢菌毒素处理雷公藤后，40%毒素的处理效果最好．

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