王 卫，陈义挺，陈 婷，黄新忠，陈小明，胡 薇

(1．福建师范大学生命科学学院，福建 福州350108;2．福建省农业科学院果树所，福建福州350013)

猕猴桃(Actinidia chinensis)是落叶藤本果树，雌雄异株，属猕猴桃科猕猴桃属．我国是猕猴桃的原产中心，在长江流域以南的各地，以及北至陕西、四川、河南等地均有猕猴桃分布［1］．猕猴桃不仅营养价值高，而且还有提高免疫力、改善消化不良、治疗呼吸疾病、预防心血管疾病等药用功效［2］．目前关于猕猴桃的研究主要集中在资源与育种、栽培及病虫害防治、生理与生化、贮藏与加工等方面［3］，尚未见利用相关序列多态性(sequence related amplified polymorphism，SRAP)研究猕猴桃的报道．该技术是一种基于PCR的新型分子标记技术［4］，具有简便、高效、重复性好、易测序和便于克隆目标片段等特点，目前已成功应用于果树、蔬菜及作物等种质资源研究、遗传图谱构建、重要性状标记、相关基因测序与克隆分析［5－6］等方面．本研究选用猕猴桃叶片作为试材，利用均匀设计试验优化SRAP-PCR反应体系，为猕猴桃种质资源分析奠定基础．

1 材料与方法

1．1 材料与试剂

1．1．1 材料 猕猴桃叶片取自福建建宁，品种为毛花、米良、D13、D25、红阳、金魁．

1．1．2 试剂 Mg2+、dNTPs和标准分子量(marker)DL2000均购自TaKaRa公司，Taq DNA聚合酶购自上海申能博彩生物科技有限公司，引物由上海生物工程有限公司合成．无水乙醇、氯仿等为国产分析纯．

1．2 方法

1．2．1 DNA提取和质量检测 采用改良CTAB法提取猕猴桃基因组DNA［6］，利用0．8%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA提取效果，并用超微量紫外分光光度计(Thermo Nanodrop 2000)检测DNA浓度和纯度，然后将DNA浓度稀释为30 ng·μL－1，－20℃贮存备用．

1．2．2 SRAP多态性引物的筛选 选用毛花猕猴桃和米良猕猴桃DNA作为模板，以电泳得到的带谱清晰、数目较多为筛选原则，对本试验所用的SRAP引物(共100个组合)进行筛选(表1)．

表1 引物序列Table 1 The primer sequences

1．2．3 均匀设计试验优化SRAP-PCR体系 根据均匀设计的原理及特点，本实验采用两轮均匀设计进行．第1轮用均匀设计表U25(55)［7］对Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA进行5因素5水平的筛选分析．参考相关文献，确定各因素的水平［8－9］，并按照表2进行试验．

表2 均匀设计表U25(55)1)Table 2 Uniform design table of U25(55)

对第1轮试验结果进行分析，初步筛选出较优组合，并以此作为第2轮优化的依据．选择均匀设计表U12(35)进行第2轮优化试验(表3)．

表3 均匀设计表U12(35)1)Table 3 Uniform design table of U12(35)

通过对上游、下游引物各10条，共100个引物组合进行初步筛选，确定采用引物组合ME10+EM8，按照表2和表3中各因素的体积制备25 μL的SRAP体系，并进行PCR扩增．PCR扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min，35℃复性1 min，72℃延伸1 min，5个循环;94℃变性1 min，51℃复性1 min，72℃延伸1 min，35个循环;最后72℃延伸10 min．采用1．5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物．

1．2．4 SRAP扩增程序优化 优化循环次数:以两轮优化筛选出的最佳因素水平组合作为反应体系，每次试验均分别以毛花和米良猕猴桃DNA为模板，对SRAP扩增程序中的循环次数进行优化．前5个循环不变，第2轮循环数依次设为30、33、35个．

优化退火温度:每次试验均分别以毛花和米良猕猴桃DNA为模板．前5个循环复性温度不变，设置为35℃，第2轮循环数设置为35个，退火温度依次设为50、52、54℃．

2 结果与分析

2．1 基因组DNA的提取

采用改良CTAB法提取猕猴桃基因组DNA，经琼脂糖凝胶电泳检测(图1)．紫外分光光度计检测结果为:D260nm/D280nm值为1．8 －2．0，D260nm/D230nm＞2．说明DNA质量较好，可以用于SRAP-PCR反应．

2．2 SARP多态性引物组合的筛选结果

采用参考文献［8］的SRAP-PCR扩增体系对100个引物组合进行筛选(图2)，根据引物的筛选原则，选取引物组合ME10+EM8作为本次试验的引物，进行后续的PCR体系优化．

2．3 SARP反应体系的均匀设计优化结果

图1 猕猴桃基因组DNA电泳图Fig．1 Electrophoretogram of Actinidia genomic DNA

以ME10+EM8作为引物，分别选取毛花DNA(图3)和米良DNA(图4)作为模板，按照表1进行第1轮优化设计．其中，6、8、19和25泳道基本没有条带，可能是由于Mg2+或者模板浓度太低所导致;1、2、3、12、18和23泳道条带模糊，可能由于引物浓度过高导致条带不清晰;9号泳道的条带较多且清晰．因此，第1轮的优化结果为:25 μL 体系含有3 mmol·L－1Mg2+，0．3 mmol·L－1dNTPs，0．2 μmol·L－1引物，Taq DNA聚合酶 1．25 U，模板 DNA 120 ng．

利用均匀设计优化反应体系时，一般都需要进行两轮试验．本试验将9号泳道对应的因素水平进行第2轮优化．以毛花DNA(图5)和米良DNA(图6)为模板，按照表3进行的5因素3水平的第2轮优化．其中，12号泳道基本没条带，5号泳道在两个模板中均得到较好的结果，条带数量较多且清晰．因此，猕猴桃SRAP-PCR 最佳反应体系(25 μL):Mg2+2．5 mmol·L－1，dNTPs 0．25 mmol·L－1，引物 0．2 μmol·L－1，Taq DNA 聚合酶1．25 U，模板 DNA 150 ng．

图6 第2轮优化反应的结果Fig．6 The second round of optimization results

2．4 SRAP-PCR扩增程序的优化结果

退火温度对SRAP-PCR反应有显著影响．一般前5个循环复性温度为35℃，第2轮循环的退火温度≤54℃．低复性温度能确保两个引物与靶DNA部分配对，随后提高循环复性温度，保证前5个循环的扩增产物可在余下循环中进行指数式扩增［10］．退火温度在52和54℃时，条带较清晰，50℃时较模糊，因此可选用53℃作为退火温度(图7)．

循环次数对SRAP-PCR反应的产物也有较大影响，循环次数太少，扩增产量较低，电泳条带较弱;循环次数太多，达到饱和进入平台期会导致产生弥散．循环次数为30和33个时，条带较多且清晰，35个循环时有弥散，因此选择33个循环即可(图8)．

图7 退火温度对SRAP-PCR反应的影响Fig．7 Effect of annealing temperature on the SRAP-PCR reaction

2．5 SRAP反应体系的稳定性

分别以毛花、米良、D13、D25、红阳、金魁为模板，运用上述SRAP-PCR优化体系和扩增程序，进行PCR扩增，验证该体系的稳定性．结果表明，扩增条带清晰且丰富(图9)，适合于后续研究．

图8 循环次数对SRAP-PCR反应的影响Fig．8 Effect of number of PCR cycles on the SRAP-PCR reaction

图9 6个猕猴桃品种的SRAP-PCR结果Fig．9 SRAP-PCR results of 6 varieties of kiwi fruit

3 结论与讨论

SRAP技术是一种新型的基于PCR的DNA分子标记技术，PCR过程受多种因素的影响，包括Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA，以及循环数、退火温度等．对于不同物种，这些因素的影响程度不同．Mg2+在PCR中的作用主要是dNTP-Mg与核酸骨架相互作用并能影响Taq DNA聚合酶的活性．一般的情况下，Mg2+为0．5－5．0 mmol·L－1，Mg2+浓度对PCR扩增效率影响显著，浓度过高会降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量，甚至使PCR扩增不出条带．dNTPs也是影响PCR的一个主要因素，高浓度的dNTPs对扩增反应起抑制作用，浓度过低会导致效率降低，甚至扩增不出条带．本实验利用均匀设计对猕猴桃的SRAP反应体系进行优化，获得的最佳反应体系为(25 μL):Mg2+2．50 mmol·L－1，dNTPs 0．25 mmol·L－1，引物0．2 μmol·L－1，Taq DNA 聚合酶1．25 U，模板 DNA 150 ng．扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min，35℃复性1 min，72℃延伸1 min，5个循环;94℃变性1 min，53℃复性1 min，72℃延伸1 min，33个循环，72℃延伸10 min．

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