刘一萌，马家海，文 茜

(上海海洋大学水产与生命学院，上海201306)

坛紫菜(Porphyra haitanensis)作为我国特有种［1］，是我国产量最高的紫菜栽培种．但是，随着海区环境的恶化，紫菜病害的暴发越来越频繁，其中，紫菜赤腐病(red rot disease)是危害严重又经常发生的病害之一．紫菜赤腐病是由紫菜腐霉(Pythilum porphyrae)感染引起的真菌性病害．国外最先在条斑紫菜(Porphyra yezoensis)上研究该菌，将该菌分类于腐霉菌科的腐霉属(Pythilum)［2］，并定名为 Pythilum porphyrae［3］;而有关坛紫菜赤腐病的研究较少，且多见于其病害的防治．

紫菜腐霉在分类学上的分类阶元为卵菌门(Oomycota)卵菌纲(Oomycetes)霜霉目(Peronosporates)腐霉科(Pythiaceae)腐霉属［4］．腐霉属隶属卵菌门，该属菌种分布广泛，我国发现的腐霉种有56种［5］．腐霉属真菌可存在于土壤以及水环境中，多数为致病菌［6］，如瓜果腐霉引起的黄瓜猝倒病［7］等，会给农业生产造成严重损失，部分可使动物甚至人类产生疾病［8］．

腐霉菌的分类鉴定主要依靠形态学方法［9］，但由于腐霉一些重要的形态结构不稳定，给形态学鉴定带来了困难．因此，分子生物学方法逐渐成为腐霉菌鉴定的重要手段［10］．本研究以2011年10月－2012年2月在福建省部分坛紫菜栽培海区采集到的患有病烂的坛紫菜为研究对象，以形态学鉴定为基础，结合转录内间隔区(internal transcribed spacer，ITS)序列，对坛紫菜赤腐病的病原菌进行分离鉴定，为赤腐病的防治提供理论依据．

1 材料与方法

1．1 材料来源

坛紫菜样品取自福建省福鼎市、霞浦县、泉州市和晋江市等坛紫菜栽培海区，经阴干后低温条件下迅速带回实验室．

1．2 病症检查方法

将培养的患有病烂的坛紫菜或冰箱中保存的坛紫菜用海水复苏培养后，切取患病部位叶片组织，利用显微镜Olympus Bh41、相机MicroPublisher 5．0 RTV，观察病症部位，并记录病症特征．

1．3 腐霉菌丝的分离、纯化

配制半海水玉米琼脂培养基(corn-meal seawater agar，CMSA)［11］:玉米粒20 g，琼脂18 g，蒸馏水500 mL，海水500 mL．取1 cm2患病部位的坛紫菜叶片，用消毒毛笔在灭菌海水中反复刷洗3次，并置于装有灭菌海水的三角烧瓶中，120 r·min－1震荡5－10 min，如此反复2次后，将叶片平铺于CMSA上．25℃培养5 d，可见腐霉菌丝伸展，用打孔器抠取含菌丝的培养基，并置于新鲜培养基上，反复提纯3次，将得到的菌丝体命名为FM1．

1．4 菌丝体扩大培养

配制半海水玉米液体培养基，刮取一小块经纯化的腐霉菌丝块置于液体培养基中，20℃、120 r·min－1震荡培养3 d，可见菌团生成．

1．5 人工感染试验

用分离纯化获得的菌丝体对健康坛紫菜叶状体进行感染试验，并置于光照培养箱内充气培养．培养条件:水温15 ℃，盐度为26．9，光照度48．07 －64．10 μmol·m－2·s－1，光周期10L∶14D．每3 d 添加1 次 PES培养液，添加量为水体积的2%．

1．6 核糖体DNA(rDNA)ITS序列分析

1．6．1 样品收集与处理 将菌丝体在半海水玉米液体培养基中培养7 d后，用3层医用无菌纱布滤出菌丝体，并用无菌半海水清洗3次，再用无菌滤纸过滤并收集菌丝体．经干燥处理后，置于离心管中，－20℃保存备用．

1．6．2 DNA制备及目标序列获取 DNA制备方法参照Park et al［12］，并略做改动．称取0．01 g菌体置于液氮中研磨成粉末，并转移到离心管中．加入1 mL CTAB提取缓冲液(2%CTAB，0．1 mol·L－1Tris-HCl pH 8．0，0．05 mol·L－1EDTA pH 8．0，1．4 mol·L－1NaCl，0．2%β-巯基乙醇)，65 ℃温浴 30 min 后，加入1/2 体积氯仿/异戊醇(24∶1)，65 ℃温浴30 min，15 ℃、12000 r·min－1离心15 min．将上清液转移至新管中，加入1/10 CTAB和等体积异丙醇，4℃、12000 r·min－1离心15 min，待DNA沉降后，用70%乙醇洗涤1－2次，在无菌风下吹干或室温干燥，溶于1×TE溶液中，－20℃保存备用．

PCR扩增采用真核生物核糖体基因ITS序列，包含5．8S序列，引物序列为ITS1(5'-TCCTCCGCTTATTATATGC-3')、ITS2(5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAA GG-3')．反应条件:95 ℃变性1 min，55 ℃退火0．5 min，72℃延伸1 min，共30个循环，反应前95℃预变性1 min，循环结束后72℃延伸5 min．将PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色后，用紫外光检测．引物合成、扩增产物纯化及测序由生工生物工程(上海)有限公司完成．

1．6．3 数据分析 采用Bioedit和 ClustalX(Ver 1．83)，分别对样品ITS+5．8S序列进行编辑和对齐．通过NCBI软件进行BLAST同源性比对，其他序列均来自GenBank．应用软件MEGA 4．1以邻接法构建系统发育树，自举检验值1000次检验节点置信度．

2 结果与分析

2．1 病烂症状

坛紫菜叶片上有不同大小的病斑，直径为1 mm－3 cm，呈圆形或椭圆形．随着病情的发展，斑点逐渐扩大，相互连接，形成大的斑块．病斑初期为紫红色或铁锈红色，与周围健康紫菜区别较明显，之后病斑由中心至周围逐渐变成绿色或黄绿色，有时可见绿色病斑部位带有红色水泡(图1A)，水泡多呈圆形，大小在1－8 mm．紫菜离水后不久，水泡便会破碎，流出红色液体，露出绿色或浅绿色病斑，这些病斑随即溃烂成孔洞，此过程仅需5－7 d．溃烂后，孔洞边缘的叶片依然呈紫红色(图1B)，其周围的正常紫菜叶片在随后几天也转为紫红色．

图1 紫菜腐霉侵染过程Fig．1 The life cycle of Pythium porphyrae

2．2 镜检结果

镜检发现，在正常紫菜被感染过程中，起初仅有1个细胞被菌体感染，与正常紫菜细胞(图1C)相比，被感染的细胞萎缩，颜色加深，并伸出菌丝侵染临近的细胞(图1D)，菌丝体逐渐伸长，侵染下一个细胞，且菌丝体上会形成分枝，加速了侵染速度(图1E)，逐渐在该部位形成病斑(图1F)．被穿透的紫菜细胞死亡并萎缩为原来体积的1/3，甚至更小，颜色呈深红色．随着病情发展，菌丝体穿透的紫菜细胞发生腐烂，有时可看到腐烂的紫菜细胞周围伴有桃红色针状或块状的藻红素结晶析出，色泽由深红色逐渐变为绿色或黄绿色(图1G－K)．最后，细胞内容物消失，只残留细胞壁，并逐渐溃烂形成孔洞．在绿色病斑处，部分被菌丝体穿透的紫菜细胞破裂，菌丝体外露(图1L)．

菌丝体无色透明或半透明，一般无隔膜，部分老旧的菌丝体内有隔膜(图1G－H)，一般无颗粒，少数有颗粒存在(图1I)，直径为1．2－3．5 μm．同一条菌丝体上，伸出的端菌丝较细．最初，紫菜细胞可被1条菌丝体贯穿，随着病情的蔓延，有时可见被3－5条菌丝贯穿的现象(图1G)．菌丝体穿入紫菜细胞后，其末端在紫菜细胞间膨大形成球囊，并将紫菜细胞排挤到一侧(图1M)，该球囊直径为12．5－18．0 μm，为孢子囊，该球囊内起初可见絮状填充物，之后发育成淡青色颗粒，为游动孢子．游动孢子呈肾脏状，大小为(2．0－3．5)μm×(6．0－9．0)μm，在其腹部有一纵沟，从该纵沟分别向前、后各伸出1条鞭毛，2条鞭毛长度相同(图1N)．游动孢子释放后，遇到紫菜便会附着在其表面，呈圆形，鞭毛随之消失(图1O)．孢子附着后很快萌发出萌发管，侵染紫菜细胞(图1P)．部分菌丝体穿入紫菜细胞后，可在细胞内膨大成一球状囊体(图1Q)，呈淡青色，直径为15－20 μm．此为菌丝体的有性繁殖器，即藏卵器(oogonium)，其外侧有一无色弯曲的半球体，即雄器(antheridium)，大小为(2．0－3．5)μm ×(5．5 －7．0)μm，菌丝体受精后便发育成一个不动的厚壁卵孢子(oospores)．

2．3 感染结果

分离纯化得到的FM1菌株感染健康坛紫菜后，坛紫菜叶片有菌丝体出现，被菌丝体穿透的坛紫菜细胞死亡并萎缩，表现出典型的赤腐病症状，与自然海区的病菜症状一致．

2．4 ITS系统发育分析

经PCR扩增，FM1菌株的序列全长为870 bp，用Blast软件将该序列与NCBI中登记的ITS+5．8S序列进行同源性比对，结果表明其与腐霉属同源性较高，达到98% －99%．以疫霉属(Phytophthora)为外群，将该菌与腐霉属其他种以ITS+5．8S序列构建N-J系统发育树(图2)．结果显示，FM1菌株与Pythium porphyrae(紫菜腐霉)聚为一类．

图2 基于ITS构建的N-J系统发育树Fig．2 N-J phylogenetic tree based on rDNA-ITS sequence analysis

3 讨论

本研究采集到的患有病烂的坛紫菜中，由菌丝穿透紫菜细胞，致使紫菜细胞死亡并萎缩的发病症状、发病进程，与条斑紫菜赤腐病［7］相符，引起该病害的病菌菌丝有无性生殖和有性生殖2种方式．无性生殖通过菌丝形成孢子囊，孢子囊内产生双鞭毛游动孢子进行;有性生殖通过雄器和藏卵器之间的配合进行，并产生不动的厚壁有性孢子，即卵孢子，卵孢子在藏卵器内发育成熟，一个藏卵器内仅含有一个卵球，发育后形成一个卵孢子．卵孢子厚壁的抗逆性结构可保护卵孢子抵抗不良环境条件．本研究中，分离菌的孢子囊、游动孢子、雄器和藏卵器等结构，与日本水产学会［13］描述的引起条斑紫菜赤腐病的紫菜腐霉结构相同．

因rDNA在进化过程中保守性强，被应用于大部分生物的分类和鉴别中，其中，rDNA ITS是目前腐霉属菌种分类研究最常用的区域．本研究中，ITS序列分析显示，样品FM1与Pythium porphyrae(GenBank登录号分别为 HQ643753．1、AB043506．1、AB185111．1)聚为一类．因此，根据菌株孢子囊、游动孢子、雄器和藏卵器等结构的特点，以及序列分析结果，将该菌株鉴定为紫菜腐霉，由腐霉菌丝穿透紫菜细胞引起的病害确定为赤腐病．

坛紫菜赤腐病在各个沿海地方曾有不同的名称．黄海水产研究所紫菜组［14］提到的红泡烂和洞烂、福建省水产局［15］描述的红泡病，以及王忠民［16］提及的红泡病(俗称铁钉锈斑)的病状与本文描述的赤腐病相同．中国科学院海洋研究所［1］曾提到，我国紫菜栽培过程中，俗称的红泡病，从病状和发病条件，以及显微镜观察到的菌丝等与日本描述的赤腐病一致．浙江省水产局［17］也指出，从病症和菌丝贯穿细胞情况比较分析，福建的红泡烂、浙江的洞烂、江苏的烂菜与赤腐病相似，此病在我国坛紫菜和条斑紫菜栽培中都有局部或大面积发生．紫菜发生赤腐病时，病斑处的紫菜细胞被腐霉菌丝体穿透而死亡、萎缩，藻红素等随即溶出，并滞留在紫菜细胞间．随着菌丝体贯穿细胞数量的增多，越来越多的藻红素等物质溶出并在细胞间累积，致使紫菜表面病斑处叶片隆起，形成红色的水泡．因此，“红泡病”或“红泡烂”即为“赤腐病”．

［1］中国科学院海洋研究所．中国经济海藻志［M］．北京:中国科学出版社，1962．

［2］新崎盛敏．アサクサノリの腐敗病に關する研究［J］．日本水産学会誌，1947，13:74－90．

［3］TAKAHASHI M．Identification of genus Pythium［J］．Plant Prot，1970，24(8):339 －346．

［4］魏景超．真菌鉴定手册［M］．上海:上海科学技术出版社，1979．

［5］袁高庆，赖传雅．广西南宁地区腐霉的研究［J］．中国生态农业学报，2004，12(3):149－152．

［6］柴兆祥，李金花，楼兵干，等．玉米根围土壤中腐霉菌的分离鉴定及核糖体DNA-ITS序列分析［J］．草业学报，2009，18(3):126－135．

［7］YU T F．Pythium damping-off of cucumber［J］．Agric Sin，1934，1:91 －106．

［8］楼兵干，张炳欣．基于rDNA ITS序列探讨部分腐霉种的系统发育与其形态特征［J］．菌物学报，2005，24(2):207－220．

［9］余永年，马国忠，刘晓娟．腐霉属分类性状评价及其中国的种［J］．真菌学报，1990，9(4):249－262．

［10］陈秀贤，曾会才，HO H H，等．分子生物学技术在腐霉菌分类上的应用研究［J］．生物技术通报，2007(5):84－88，92．

［11］SASAKI M，SAKURAI Y．Comparative observations on the growth among the five strains in Pythium porphyrae under the same culture conditions［J］．Bull Tohoku Reg Fish Res Lab，1972，32:83 －87．

［12］PARK C S，KAKINUMA M，AMANO H．Detection of the red rot disease fungi Pythium spp．by polymerase chain reaction［J］．Fish Sci，2001，67:197 －199．

［13］日本水产学会．紫菜的病害［M］．韩书文，鲁守范，译．北京:农业出版社，1978．

［14］黄海水产研究所紫菜组．坛紫菜与条斑紫菜养殖［M］．北京:农业出版社，1979．

［15］福建省水产局．坛紫菜人工养殖［M］．福州:福建人民出版社，1979．

［16］王忠民．紫菜升降式养殖技术［J］．水产养殖，2006，27(4):41 －42．

［17］浙江省水产局．紫菜增、养殖和加工技术［M］．杭州:浙江科学技术出版社，1999．