朱雄伟，张佑红，徐智鹏，苏腾甲，熊 瑶，翟莉莉

（武汉工程大学化工与制药学院，绿色化工过程省部共建教育部重点实验室，湖北 武汉 430074）

0 引 言

免疫学技术正沿着基础研究－应用研究－高技术开发研究3条主线在开展，三者互相促进，推动现代医学的发展［1］．杂交瘤技术的建立和细胞因子对免疫细胞发育、分化的发现，基因工程技术的发展，使实验室的研究直接转向生物高技术产品的开发，如重组细胞因子、单克隆抗体及其相应的试剂盒、多克隆抗体、基因工程抗体和疫苗等已经或正在投入临床使用，特别是抗体药物以其对人体无毒无副作用、完全天然和高度特异性的疗效，越来越显示其优势，并创造出巨大的社会效益和经济效益［2］．

1962年，Ashford等［3］报道在电子显微镜下发现肝细胞自噬现象，近年来由于发现与自噬相关的基因，以及自噬在生物体生理和病理等方面的作用，自噬基因融合蛋白（ATG12）是与自噬相关基因表达的蛋白．本研究合成带谷胱甘肽转移酶（GST）标签ATG12融合蛋白来免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗体，并用免疫亲和纯化方法提纯抗血清中的多克隆抗体、酶联免疫吸附法（ELISA）检测抗体效价、蛋白印迹（Western blotting）检测抗体特异性及在组织中的表达情况、聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）检测其浓度．

1 实验部分

1．1 材 料

1．1．1 研究对象 新西兰大白兔．

1．1．2 实验试剂 抗原；乙醇；20 mmol／L 磷酸缓冲溶液p H 7．2；福氏佐剂；GST透析液；His溶液；PBS溶液；couping buffer；p H 5．0的甘氨酸；p H 2．0的 HCl溶液；1 mol／L Tris封闭液；p H 5．0 HCl溶液；CBB 溶液；0．01 mol／L Tris p H 7．5中和液；甘油；防腐剂Na N3；HRP酶标二抗；质量分数2%SKL；beads；0．01 mol／L PBS（p H 7．3）；10% 分离胶；质量分数4% 浓缩胶；G250考马斯亮蓝溶液；0．15 mol／L NaCl溶液；2×（5×）SDS上样缓冲液；甲醇；电泳缓冲液；转移缓冲液；10×丽春红染液、封闭液；TBST；TBS；ECL显影底物；显影液；定影液；DAB溶液；化学发光试剂、HRP酶标二抗；脱脂奶粉；1 mol／L的Na HCO3；TMB显色液；所有试剂均为分析级．

1．2 实验方法

1．2．1 抗血清的制备 具体方法如下［4］：

a．新西兰大白兔的免疫．免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等，一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0．1 mL左右．抗原剂量，首次剂量为300～500μg，加强免疫的剂量约为首次剂量为1／4左右．每2～3周加强免疫一次．加强免疫时用不完全佐剂，首次免疫时皮下注射百日咳疫苗0．5 m L，加强免疫时不必注射百日咳疫苗．在第2次加强免疫后2周，从耳缘静脉取2～3 m L血，制备血清，检测抗体效价．

b．抗血清的采集与保存．取兔血有两种方法，一是耳缘静脉或耳动脉放血，一是颈动脉入血，也可心脏采血．取动脉或静脉放血时，将兔放入一个特造的木匣或笼内，耳露于箱（笼）外，也可由另一人捉住兔身．剪去耳缘的毛，用少许二甲苯涂抹耳廓，30 s后，耳血管扩张、充血．用手轻拉耳尖，以单面剃须刀或尖的手术刀片，快速切开动脉或静脉，血液即流出，每次可收集30～40 m L．然后用棉球压迫止血，凝血后洗去二甲苯．二星期后，可在另一耳放血．此法可反复多次放血．颈动脉放血时，将兔仰卧，固定于兔台，剪去颈部的毛，切开皮肤，暴露颈动脉，插管，放血．取收集的血液在37℃恒温箱中放置30 min以防止激活补体系统，再将试管在4℃放置过夜使血液凝固．用药铲将血凝块从管壁上拨落，将血液转移至塑料离心管中，于4℃下4 000 r／min离心10 min．在无菌条件，吸出血清，分装，可在－20℃保存数年．

1．2．2 抗体的纯化 具体步骤如下［5］：

a．抗原柱子的制备．找到相应的血清和抗原、抗原的透析（对非包涵体蛋白）、活化beads、抗原与beads连接、封闭beads．

b．抗血清的预处理．将解冻好的血清在3 600 r／min，条件下离心17 min；除去离心后浮在表面的脂肪，将血清转移到标记好的瓶子中备用，注意尽量不要将沉在管底的血细胞倒出；对免疫原是GST融合蛋白的血清，同时是纯化抗原也是GST融合蛋白，此时需过GST柱子，吸附掉anti－GST的抗体．注意此时要留抗原小样，做ELISA检测看anti－GST的抗体有没有除尽．

c．beads与对应的抗血清的结合．将连接好抗原的beads和对应的抗血清一起孵育，封口后排气，在转子上固定好，孵育，室温2 h或4℃过夜，让血清流出纯化管，收集，10 m L PBS洗涤三次．

d．收集抗体．加入10 mL p H5．0甘氨酸，预洗脱，加入预冷的HCl洗脱液．同时检测收集的抗体浓度，确定收集峰，收集浓度高抗体，于4℃暂时保存．

e．浓缩和透析．将浓度不高的抗体吸水浓缩，注意放4℃保持低温．浓缩好后透析．次日检测收集的抗体浓度，确定收集峰．收集浓度高抗体，于4℃暂时保存．

f．beads的清洗和保存．依次用Tris和PBS洗，加入甘油、防腐剂－20℃保存．

1．2．3 ELISA 检测［6－8］a．抗原包被．用抗原包被液（1 mol／L的 Na HCO3）稀释抗原，50微升／孔，蛋白量为2～3μg／m L，孵育，室温2 h或4℃过夜，用GST标签蛋白作对照．

b．封闭．倒出孔内溶液，拍干，每孔加入100 u L稀释液 （3% 脱脂牛奶＋PBST），封闭，放摇床上室温孵育1 h．

c．加一抗．倒出孔内溶液，拍干，洗3次，每次5 min．倒出孔内溶液，拍干，加入一抗，摇床上室温孵育1 h．

d．加二抗．倒出孔内溶液，拍干，洗三次，每次5 min．倒出孔内溶液，拍干，加入二抗，摇床上室温孵育1 h．

e．加底物显色．TMB显色液A、B按1∶1混合，100μL／孔，放摇床上15 min内观察结果，照相．

f．SDS－PAGE电泳．电泳时间一般4～5 h，电压为40 V较好，也可用60 V．电泳至溴酚蓝刚跑出即可终止电泳，进行转膜．

g．转 膜．

（1）转一张膜需准备6张7．0～8．3 cm 的滤纸和1张7．3～8．6 cm的PVDF膜，将切好的PVDF膜置于甲醇上浸才可使用．

（2）在加有转移液的塑料盒里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜．

（3）将夹子打开使黑的一面保持水平．在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡．

（4）要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬．撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻璃板．小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡．在膜上盖3张滤纸并除去气泡．最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子．整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡，膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路．

（5）将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面．电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温．一般用60 V转移2 h或40 V转移3 h．（6）转完后将膜用1×丽春红染液染5 min，然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白．将膜晾干备用．

h．免疫反应．

（1）将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1 h．

（2）将一抗用TBST稀释至适当浓度，撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整；将抗体溶液加到保鲜膜上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，室温下孵育1～2 h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，再用TBS洗一次．

（3）准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育1～2 h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10 min；再用TBST洗一次，10 min，进行化学发光反应．

i．化学发光、显影、定影［9－10］．

（1）将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合，1 min后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触，1 min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入暗盒中．

（2）在暗室中，将1×显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出胶片，用切纸刀剪裁适当大小；打开暗盒，把胶片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上暗盒，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1 min或5 min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；曝光完成后，打开暗盒，取出胶片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影．显影时间一般为1～2 min（20～25℃），显影结束后，马上把胶片浸入定影液中，定影时间一般为5～10 min，以胶片透明为止，用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干．

2 结果与讨论

2．1 GST柱子分析

免疫原是GST融合蛋白的血清，同时是纯化GST柱子的穿流夜Ft GST融合蛋白，此时需过GST柱子，用来吸附掉anti－GST的抗体．图1所示的是未过GST柱子的血清F和GST柱子的穿流液Ft加入TMB底物后显色反应，表1所示的是血清F与穿流液Ft的稀释梯度［11－12］．

表1 血清F与穿流液Ft的稀释梯度Table 1 Dilution gradient of serum F and transit fluid Ft

图1 血清F（“1”）与穿流液Ft（“2”）的显色反应Fig．1 Chromogenic reaction of serum F and transit fluid

由图1和表1可知：在四种梯度下，血清F加TMB底物显色后四孔全部显蓝色，而穿流液Ft全部无色，说明anti－GST已除干净．

2．2 ELISA结果分析

图2所示的是未过GST柱子的血清F、GST柱子的穿流液Ft和抗体Pu加入TMB底物后显色反应、表2所示的是血清F、穿流液Ft和抗体Pu的稀释梯度．

图2 血清F、穿流液Ft、抗体Pu的显色反应Fig．2 Chromogenic reaction of serum F，transit fluid Ft and antibody Pu

由图2和表2可知，以Ft为参照，F、Ft、Pu显色孔数依次为4，3，4，其中Ft的是底色．结果说明血清还可以进一步纯化，而且收集的纯化血清效果也不错，即稀释度为1：500 000．

表2 血清F、穿流液Ft、抗体Pu的稀释梯度Table 2 Dilution gradient of serum F，transit fluid Ft and antibody Pu

2．3 SDS－PAGE测定 ATG 12多克隆抗体浓度［13］

使用SDS－PAGE测定蛋白质浓度，图3所示的是ATG12多克隆抗体的SDS－PAGE图．如图3所示：左边的条带为ATG12蛋白，右边为marker条带，marker的分子质量图中已经标出．以67 k D为参照来估测蛋白浓度，67 k D代表的marker质量浓度为每10μL含8μg，而目的蛋白的颜色只有其5／8深，则蛋白浓度为每10μL 5／8×8μg，即每10μL为5μg．

图3 ATG12多克隆抗体的SDS－PAGEFig．3 SDS－PAGE of ATG12 polyclonal antibody

图4 免疫印记蛋白质大小Fig．4 Size of Immune mark protein

2．4 Western blotting分析

图4所示的是免疫印记蛋白质大小及在Colon（结肠）中的表达条带中的表达情况．

由图4可知：Western blotting条带上的点清晰，说明其能在结肠中较好的表达，由图知蛋白质大小为55 k D左右．

3 结 语

使用带GST标签的融合蛋白免疫新西兰大白兔，制备得到ATG12多克隆抗体，运用ELISA及Western blotting检测结果显示此抗体效价及特异性较高，Western blotting检测结果显示其在结肠组织中表达，SDS－PAGE结果显示其浓度也较高．本研究成功得到浓度较高的ATG12多克隆抗体，并证实其在结肠组织中表达较明显．

致谢

感谢天惠生物公司对本研究的支持与帮助．

［1］周建光，杨梅．免疫学技术的发展及临床应用［J］．医疗装备，2011，24（7）：49－51．

［2］孔维，杨文辉．单克隆抗休及其应用的研究进展［J］畜牧兽医科技信息，2009（1）：9－11．

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