敖 翔，唐爱国，罗昔波，皮兰敢，章 清

近年来，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)对人致病作用明显增强，成为一系列严重化脓性感染尤其是支气管扩张、慢性支气管炎、囊性肺纤维化等疾病继发感染的重要致病菌[1-2]。随着抗菌药物的广泛应用，细菌的耐药性越来越严重且有明显的上升趋势，给临床治疗造成了极大困难[3]。目前为止，研究者们发现的PA耐药原因有以下几个方面：外膜的通透性降低，外排蛋白D2缺失[3]，药物的主动外排系统作用[4-9]，β-内酰胺酶、氨基糖苷钝化酶的产生，靶位的改变以及细菌生物被膜的形成。本研究通过在PA菌液中加入硅纳米颗粒并进行培养，观察硅纳米颗粒是否能进入并存留在PA内，旨在探讨PA主动外排泵对PA摄入硅纳米颗粒的影响，为将其作为药物载体提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集中南大学湘雅二医院2007年1—6月检测的PA临床菌株24株，分别编号为S1～S24，均采用Micro Scan Walk Away 96微生物鉴定系统进行鉴定。PA01为PA的野生菌株，作为MexA基因的阳性对照，来自西北大学中科院分子微生物实验室；ATCC27853为PA的标准菌株，购自卫生部临床检验中心，符合美国临床和实验室标准化研究所(CLSI)抗微生物药物敏感性试验标准。硅纳米颗粒为自制，制作方法参照文献[10]。

1.2 主要试剂及仪器 细菌总RNA抽提试剂Trizol购自Invitrogen Life Technologies公司；TaKaRa dNTPs TaqTM及缓冲系统、6xloading buffer及DNA marker(O′GeneRuler 100bp Ladder Plus)均为晶美生物有限公司产品；引物序列参照文献[11]，由上海生工生物公司合成，Trizol试剂购自Invitrogen公司。QIAGEN One Step RT-PCR Kit购自QIAGEN公司。主要仪器有超净工作台(苏州净化)，Eppendorf台式低温微量离心机，凝胶成像分析系统(Bio-Rad)，琼脂糖水平电泳仪(Bio-Rad)，二氧化碳(CO2)培养箱(Forma 公司)。

1.3 方法 PA菌株根据《全国临床检验操作规程》第3版按常规方法进行培养，将24株PA临床菌株用Trizol试剂抽提总RNA，采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)一步法扩增引物，进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪下成像[9]。将筛选出的6株PA临床菌株及野生菌株PA01培养到对数增长期，分别以终浓度为30 μg/ml(高浓度组)和终浓度为6 μg/ml(低浓度组)的硅纳米颗粒加入到菌液中，培养2、4、8、12、24 h时取样并在电子显微镜下观察硅纳米颗粒摄入情况。

2 结果

2.1 电泳结果 电泳结果显示，24株PA临床菌株菌液中均有不同程度的外排泵基因表达(见图1～4)，其中6株(S4、S9、S12、S13、S20、S24)菌液中同时包含两种以上主动外排泵基因。

2.2 纳米颗粒摄入情况 电子显微镜观察结果显示，硅纳米颗粒在菌液内的分布无特异性，均能通过胞膜进入胞内，分布在细胞器和胞质中；仅表达1种外排泵基因(MexA)的PA01与同时表达4种外排泵基因(MexA、MexC、MexX、MexE)的S24摄入的硅纳米颗粒情况相似(见图5)；PA01菌液培养2 h时可以发现硅纳米颗粒摄入，以12、24 h时硅纳米颗粒摄入最多，且摄入情况相似(见图6)；高浓度组S24培养24 h时硅纳米颗粒摄入量是低浓度组的2倍(见图7)。

3 讨论

目前，尽管主动外排泵的作用在PA耐药机制研究中越来越受到重视，但攻克主动外排泵的外排作用这一难题仍未得到解决[12-13]。抗菌药物需要一定的浓度和作用时间才能有效杀灭细菌，而主动外排泵的存在极大地影响了抗菌药物的疗效。为特异地封闭细菌主动外排泵，人们假想了几种可能途径：在外膜通道中增加阻碍物，竞争内膜泵，改变膜的组装，瓦解主动外排泵的能量组分等[12]。1990年，革兰阴性菌泵抑制剂被研究出来后，泵抑制剂在PA中的研究也越来越多。但由于泵抑制剂的自身局限性，目前还没有一种泵抑制剂能够用于临床治疗，外排泵抑制剂的研发工作任重而道远。纳米颗粒因自身独特的优越性而被广泛用作药物载体，纳米药物载体具有增加药物在病变部位的作用时间、减少机体摄取药物总量、增加巨噬细胞对药物的摄取量等优点，并且解决了药物不能通过血-脑脊液屏障、血-睾屏障等生理性屏障这个一直让研究者们头疼的问题。

图1 外排泵基因MexA的表达情况图2 外排泵基因MexC的表达情况

Figure1 Gene expression of MexA Efflux pumpFigure2 Gene expression of MexC Efflux pump

图3 外排泵基因MexX的表达情况图4 外排泵基因MexE的表达情况

Figure3 Gene expression of MexX Efflux pumpFigure4 Gene expression of MexE Efflux pump

注：A为PA01，B为S24

图5 高浓度组菌株培养12 h时硅纳米颗粒摄入情况(×100 000)

Figure5 Result of the silica nanoparticles uptake by Pseudomonas aeruginosa in the high concentration group after 12 hours

注：A为低浓度组，B为高浓度组

图7 不同浓度组S24培养24 h时硅纳米颗粒摄入情况(×100 000)

Figure7 Result of the silica nanoparticles uptake by PA S24 in different concentration group after 24 hours

注：A～E培养时间分别为2、4、8、12、24 h，加入硅纳米颗粒浓度为30 μg/ml；F为空白对照，培养时间为12 h，加入硅纳米颗粒浓度为0

图6 PA01摄入硅纳米颗粒情况(×100 000)

Figure6 Result of the silica nanoparticles uptake by PA01

纳米颗粒可能由于其自身体积小及本身所具有的特殊效应能进入到含主动外排泵的PA体内，本实验根据药物发挥作用的时间设定了2、4、8、12、24 h 5个时间点观察硅纳米颗粒进入PA体内的情况，结果显示：菌液中加入硅纳米颗粒2 h后已经能在电子显微镜下观察到硅纳米颗粒的摄入，而以12、24 h时摄入最多。表明硅纳米颗粒不完全受主动外排泵的影响，至少有一部分硅纳米颗粒能进入到细菌体内并持续一段时间，这为硅纳米颗粒作为药物载体对抗主动外排泵的外排作用，延长抗菌药物在细菌体内的作用时间提供了实验依据。对比仅表达1种外排泵基因MexA的PA01和同时表达4种外排泵基因(MexA、MexC、MexE、MexX)的临床菌株S24硅纳米颗粒摄入情况发现，两者硅纳米颗粒摄入量相似，提示主动外排泵基因MexC、MexE、MexX的表达对菌株硅纳米颗粒摄入无明显抑制作用。由于本实验未选取不含任何主动外排泵的PA菌株作为阴性对照，所以尚不能完全排除主动外排泵对硅纳米颗粒摄入的抑制作用，但含主动外排泵的PA菌株能摄取相当数量的硅纳米颗粒，即使有少量被外出，也不影响其作为药物载体的应用。

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