张再兴

喉癌是我国北方地区最常见的头颈部恶性肿瘤之一，近几年其发病率呈上升趋势，但目前其发病机制还不十分清楚。ARHI基因是母源性印迹肿瘤抑制基因[1]，该基因定位于1p31，分子量为26 000，结构上与Ras家族具有高度同源性，属于小分子G蛋白的一种。研究表明，尽管ARHI基因属于Ras超家族成员之一，但其与大部分Ras家族成员都是癌基因不同，ARHI基因具有抑癌作用[2-3]。目前，关于ARHI基因与喉鳞癌的关系研究鲜见报道，本研究旨在探讨ARHI蛋白在喉鳞癌组织中的表达及其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择1996年11月—2012年10月在我院接受手术治疗并经两位以上病理专家确诊的喉鳞癌患者60例，其中男38例，女22例；年龄28～76岁，平均61.2岁；排除术前接受放疗及化疗的患者。

1.2 方法 手术切除癌组织后10 min内取材，取材时避免取到明显的坏死区域，同时选取其中30例患者的癌旁组织作为对照，癌旁组织为距癌组织至少0.5 cm处远端正常喉组织。采用免疫组化法(SP法)检测ARHI蛋白的表达，试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

将切取的组织标本常规石蜡包埋、切片后于60 ℃烤箱干烤4 h，常规脱蜡至水，3%过氧化氢溶液浸泡10 min灭活内源性过氧化物酶，然后加入10 mmol/L浓度pH 6.0枸橼酸钠缓冲液于100 ℃煮沸10 min，进行抗原修复；室温自然冷却30 min后加入正常马血清，室温下封闭20 min，加入一抗小鼠抗人ARHI单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology)，按1∶100稀释，4 ℃过夜，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次后加入生物素化二抗，室温30 min，PBS洗涤3次后加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，室温下封闭30 min，PBS洗涤3次，二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染，脱水透明，中性树胶封固后于光镜下进行观察。

1.3 结果判定 结果判定由两位经验丰富且不知晓本研究内容的病理科医生完成，用已知阳性切片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。结果判定方法参照文献[3-4]：每张切片随机观察10个高倍视野，每个视野计数100个细胞；根据阳性区域染色强度评分(0分：无着色；1分：淡黄色；2分：黄色；3分：棕黄色)及阳性细胞所占比例评分(0分：1%；1分：1%～10%；2分：11%～50%；3分：51%～75%；4分：76%～100%)进行半定量评分，计算两项评分的乘积，分值范围为0～12分，以乘积>3分为ARHI蛋白阳性表达。

1.4 统计学方法 使用SPSS 13.0统计软件进行分析，计数资料采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ARHI蛋白的表达 光镜观察结果显示，癌旁组织中胞质及部分胞核可见大量棕黄色颗粒(见图1)，喉鳞癌组织中胞质及胞核中可见少量棕黄色颗粒(见图2)。癌旁组织ARHI蛋白阳性表达率为83.33%(25/30)，喉鳞癌组织ARHI蛋白阳性表达率为48.33%(29/60)，喉鳞癌组织ARHI蛋白阳性表达率低于癌旁组织 (χ2=10.21，P<0.01)。

图1 癌旁组织中ARHI蛋白的表达(SP法,×400)

2.2 ARHI蛋白表达与患者临床特征间的关系 不同性别、年龄、原发部位喉鳞癌患者ARHI蛋白阳性表达率比较，差异无统计学意义(P>0.05)；临床分期Ⅰ～Ⅱ期喉鳞癌患者ARHI蛋白阳性表达率高于Ⅲ～Ⅳ期者(P<0.05)，有淋巴结转移的喉鳞癌患者ARHI蛋白阳性表达率低于无淋巴结转移者(P<0.05)，病理分级高中分化喉鳞癌患者ARHI蛋白阳性表达率高于低分化者(P<0.05，见表1)。

图2 喉鳞癌组织中ARHI蛋白的表达(SP法,×400)

Figure2 Expression of ARHI protein in laryngeal squamous cell carcinoma tissues

表1 ARHI蛋白表达与患者临床特征间的关系

Table1 Relationship between expression of ARHI protein and patients′clinical features

临床特征例数ARHI蛋白阳性表达率〔n(%)〕χ2值P值性别0.29>0.05 男3818(47.37) 女2212(54.55)年龄(岁)1.07>0.05 ≥602816(57.14) <603214(43.75)原发部位0.23>0.05 声门上区2214(63.64) 声门区3520(57.14)临床分期5.05<0.05 Ⅰ～Ⅱ2115(71.43) Ⅲ～Ⅳ3916(41.03)淋巴结转移5.45<0.05 无4842(87.50) 有1216(41.03)病理分级5.39<0.05 高中分化3731(81.08) 低分化2313(56.52)

注：有3例患者原发部位为声门下区病变，未纳入统计分析

3 讨论

喉癌中90%以上为鳞状细胞癌，而在喉鳞癌确诊时约有40%的患者已为晚期，患者5年生存率在50%以下[5]，因此，喉鳞癌的早期诊断非常重要。随着分子生物学的快速发展和癌变研究的逐渐深入，一些与肿瘤发生、发展相关的癌基因和抑癌基因相继被发现[6]。ARHI基因编码的蛋白在人类多种组织中表达，其中以正常乳腺、卵巢组织中的表达最高，而在大多数乳腺癌、卵巢癌组织中，其表达明显缺失或降低[4，7-8]。有研究发现，ARHI蛋白在胃癌组织中表达明显下调或缺失,而在胃正常组织中普遍表达，且ARHI蛋白表达与肿瘤分化程度及TNM分期有关[9]。因此，ARHI蛋白可能在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要作用。

本研究结果显示，喉鳞癌组织中ARHI蛋白阳性表达率明显低于癌旁组织，与其他学者在肝癌、前列腺癌等癌组织的检测结果基本一致[10-13]，提示ARHI蛋白表达在喉鳞癌的发生发展过程中起着重要作用。通过分析ARHI蛋白与患者临床特征间的关系发现，ARHI的低表达与患者临床分期、淋巴结转移及病理分级有关，提示ARHI蛋白可能与肿瘤组织上皮分化、病变进展及侵袭性有关。体外实验证明，ARHI蛋白可诱导胰腺癌细胞凋亡，死亡相关蛋白激酶1(DAPK-1)参与了ARHI蛋白引起的凋亡[3]。此外，也有研究发现ARHI基因可通过诱导G1期细胞而抑制癌细胞生长[1,3]。由于ARHI基因突变或失活，导致ARHI蛋白低水平表达或表达缺失，从而失去了其对细胞生长、增殖的负性调控作用，促进了肿瘤的发生和发展。

综上所述，ARHI蛋白的低表达可能是喉鳞癌发生、发展过程中的一个重要事件，检测ARHI蛋白的表达在喉鳞癌的诊断、治疗和预后评估中可能具有重要的临床应用价值，其可能成为喉鳞癌分子标志物或治疗的潜在靶点；而有关ARHI蛋白在喉鳞癌组织中表达的具体机制还有待应用分子生物学方法进一步研究。

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