关欣亮，田小丽，谢进生

马凡综合征(MFS)是15号染色体的原纤维蛋白-1基因(FBN1)缺陷导致的常染色体显性遗传性全身结缔组织病变，最早是由法国儿科医生Marfan在100多年前提出[1]。MFS患者临床表现各异，发病率为1/5 000～1/10 000，主要累及骨骼、心血管、眼睛等系统，约25%的患者是自发突变，缺乏家族史[2-3]。FBN1定位于15q21.1，包括65个外显子，长度约为235 kb，编码一种分子量为230 kDa的糖蛋白——原纤维蛋白-1，而原纤维蛋白-1是细胞外基质微纤维的重要组成部分，因此FBN1突变影响了微纤维的结构与功能[4-8]。至今已发现超过800余种的FBN1突变。FBN1由3种富含半胱氨酸的结构域组成：(1)47个表皮生长因子样结构域(EGF结构域)，其中43个EGF结构域含有钙结合共有序列，可与钙离子结合称为钙结合表皮生长因子样结构(cbEGF结构域)；(2)潜在的转化生长因子β1结合蛋白结构域(LTBP结构域)；(3)杂交分子结构域(hybrid motif结构域)[1，3-4，8-11]。近来由于分子生物学和遗传学领域的进展，分析FBN1突变对早期诊断、遗传咨询及对MFS及其类似疾病的认识具有极为重要的意义。由于MFS是一种进展性心血管疾病，一部分患儿随年龄增大症状才逐渐明显，临床表现个体差异很大，早期症状不典型，且缺乏特异性，加之大部分患儿无家族史，因此MFS患儿的诊断存在一定的特殊性。而我国对FBN1与MFS的研究还处于落后阶段，尤其对MFS患儿的早期诊断经验不足。单链构象多态性(SSCP)分析是目前应用最广泛的检测基因突变的方法之一。为此，本研究应用聚合酶链式反应(PCR)-SSCP和DNA测序技术对MFS患儿进行FBN1突变筛查。

1　资料与方法

1.1临床资料选择我院2010年1月—2011年12月心外科病房收治的MFS患儿8例，年龄均<18岁，符合1996年MFS的Ghent诊断标准[6]。

1.2方法

1.2.1DNA提取抽取2 ml外周静脉血，置EDTA抗凝管，用全血基因组DNA抽提试剂盒(QIAGEN 公司)提取DNA。

1.2.2PCRFBN1的65个外显子的PCR扩增引物分别设计在外显子两侧的内含子区域。FBN1的PCR扩增引物由北京大学分子医学研究所的田小利教授惠赠。其中，FBN1的第21号外显子的PCR扩增引物：上游引物：5′-ATATTATTCCCTCCTCTGCAG-3′，下游引物：5′-GTGGTATAGGAACCACAG-3′。第27号外显子的PCR扩增引物：上游引物：5′-CCCACCTTTAACATGGTCATT-3′，下游引物：5′-GAAAGTCTTTGCTCCTTACC-3′。第30号外显子的PCR扩增引物：上游引物：5′-CAACAACCTGTGGTGTTGG-3′，下游引物为：5′-CAACAACCTGTGGTGTTGG-3′。

PCR反应体系：10×Buffer 2 μl〔含氯化镁(MgCl2) 10 mmol/L〕，2×dNTP 2 μl (2 mmol/L),上下游引物共2 μl(10 mmol/L)，DNA模板1 μl (1 mmol/L)，Taq plus Ⅰ DNA聚合酶0.5 μl(510 U/L)，加双蒸水至100 μl。95 ℃变性1 min进入循环。95 ℃ 30 s，退火30 s，退火温度50～70 ℃(不同外显子、不同温度)。72 ℃延伸30 s，共30个循环。最后72 ℃ 再延伸7 min。

1.2.3电泳鉴定DNA取扩增产物5 μl在2%琼脂糖凝胶电泳后进行溴化乙锭(EB)染色，同时加Marker标记DNA相对分子质量进行电泳检测。

1.2.4SSCP分析硅化玻璃板后玻璃板倾斜45°灌胶，倒入新鲜配制的0.5×TBE Buffer。行300 V预电泳30 min。将5 μl PCR样品与10 μl Loading Buffer混合，水浴锅 96 ℃变性5 min，置冰上5 min。电压300 V，层析柜中电泳，300 bp电泳8 h。置于脱色摇床45 r/min，固定30 min，超纯水洗2次，置于脱色摇床45 r/min，5 min/次。将胶放入新鲜染色液中，置于脱色摇床45 r/min，染色80～90 min。盛超纯水，置于脱色摇床45 r/min，胶放入洗10 s后立即取出。将胶放入新鲜配制预冷的显色液中，观察其显色，转速可调高至100 r/min。条带出现后将胶取出，弃显色液，盛固定液，固定液固定7 min，超纯水洗净。

1.2.5PEG纯化SSCP分析现有变异带时，则将该PCR产物纯化待用。聚乙二醇(PEG)纯化：将DNA转入EP管中，加入等体积30%聚甲基丙烯酸甲酯(PM)，冰上10 min，vortex；13 000 r/min，4 ℃，20 min离心，弃上清；加入100 ml预冷75%乙醇，13 000 r/min，4 ℃，5 min，离心，弃上清；空干，加入20 ml重蒸馏水(ddH2O)。

1.2.6DNA测序与FBN1突变数据库(http://www.umd.be/FBN1/)[9]及正常人FBN1的DNA进行比对，应用全自动分析仪(ABI377型)对SSCP发现异常条带的PCR产物进行DNA测序，以确定突变位点及类型。每个突变均重复3 次。

2　结果

2.1一般资料8例MFS患儿中男女各4例；年龄1～13岁,平均(7.8±4.2)岁；家族史阳性3例(37.5%)；身高(136.5±29.6)cm，体质量(29.9±17.1)kg；心功能Ⅰ级3例，Ⅱ级1例，Ⅲ级3例，Ⅳ级1例(见表1)。6例患儿行心脏手术，其中2例行带主动脉瓣人工血管升主动脉替换术(Bentall术)；1例行左房室瓣+主动脉瓣双瓣置换术(DVR术)+ “背心式”人工血管包裹术(Robicsek术)+房间隔缺损修补术(ASD修补术)，后因急性左心衰竭、呼吸衰竭死亡；1 例行主动脉瓣置换术(AVR术)+Robicsek术+左房室瓣成形术(MVP术)+右房室瓣成形术(TVP术)；1例行保留无冠窦同种瓣置换+Robicsek术；1例行Robicsek术。手术平均年龄为(8.6±1.0)岁。术后平均随访(9.3±2.7)个月，随访期间无死亡，心功能均为Ⅰ级，生活质量明显改善。二次手术2例，1例Robicsek术后窦部扩张出现呼吸困难等压迫症状行二次Bentall术，另1例行保留无冠窦同种瓣置换+Robicsek术，后因瓣膜毁损行AVR术。所有患儿术后未发生感染、出血和血栓等并发症。

2.28例患儿中3例SSCP电泳有变异DNA条带。然后分别进行DNA测序，并与FBN1突变数据库及正常人FBN1的DNA进行对比。发现2例错义突变和1例终止密码突变(PTC突变)或称为移码突变。病例6 PTC突变(移码突变)位于16号cbEGF结构域的30号外显子第3 775位插入一碱基A产生移码突变，最终在1 267位形成TGA终止密码子。病例7是位于第13号cbEGF结构域的27号外显子第3 349位发生T→C置换TGT>CGT导致第1 117位的半胱氨酸Cys>精氨酸Arg。病例8错义突变位于第2个杂交分子的21号外显子的第2 638位发生G→A置换GGT>AGT，导致第879 位甘氨酸Gly>丝氨酸Ser(见表2)。

3　讨论

本研究中1例错义突变c.2638G>A，位于21号外显子的第2个杂交分子结构域，导致了第879位甘氨酸Gly被丝氨酸Ser替换。检索各大数据库，此突变国内外均未报道，考虑是MFS新发错义突变。此例突变发生在第2个杂交分子结构域，在MFS数据库里很少有突变涉及杂交分子结构域[12]。此例突变没有影响到半胱氨酸残基，但是此位置的甘氨酸是高度保守的氨基酸，可能通过显性负效应影响了半胱氨酸对微纤维的组装，影响了蛋白质二级结构，因此导致了MFS，但由于cbEGF结构域之间仍存在一定的钙连接，所以患者症状相对较轻，发病较晚[5]。有研究显示影响非半胱氨酸残基的患者与影响半胱氨酸残基的患者相比，在晶状体脱位的发生率上明显降低，影响半胱氨酸的错义突变与晶状体脱位有一定相关性，正常的半胱氨酸残基和二硫键在晶状体悬韧带的结构完整性上起重要作用，这点在本研究也得到了证实[8，13-16]。

本研究发现1例已知新生儿马凡综合征(Neonatal MFS)，位于27号外显子的第13号cbEGF结构域，为c.3349T>C，导致第1 117位的半胱氨酸Cys被精氨酸Arg替换。至今，FBN1的基因型-表型关系的研究显示发生在24～32号外显子的突变与Neonatal MFS密切相关[8]。Neonatal MFS与其他外显子突变的患儿相比，发病年龄早，脊柱侧凸，左房室瓣异常，升主动脉扩张和晶状体脱位的发生率更高，且生存率低，与本研究结果相似[8，12]。22%的Neonatal MFS在儿童时期发病，仅有76%存活到40岁，而在其他外显子仅有0.6%的患儿在儿童时期发病，98%的患儿能存活到40岁[8]。这种严重的MFS可能因为24～32号外显子位于cbEGF结构域的中心位置，对于微纤维的分配和稳定起着更加重要的作用[8]。

在FBN1突变数据库中，2/3的突变都是错义突变，其中大部分突变发生在cbEGF结构域，且多数影响半胱氨酸残基。有研究显示半胱氨酸残基缺失，与引入一个新的半胱氨酸残基相比，会产生更严重的结构破坏，此例患者相对发病早，且病情严重[5，13]。过多或过少的半胱氨酸残基干扰了对维持结构和钙结合至关重要的3个二硫键，不易形成稳定的反向平行β折叠结构，进而破坏FBN1或微纤维的空间构象，影响了蛋白质的二级结构；同时二硫键的丧失将直接影响cbEGF结构域的空间构象，使其结合钙的能力下降，进而降低了两个相邻cbEGF结构域的稳定性，导致蛋白水解性增高和原纤维蛋白-1的异常功能[4，6，8，12-14，17]。

表1　8例MFS患儿的临床特点

表2　3例MFS患儿的基因突变

另有1例是国内外均未报道的新发PTC突变(移码突变)，位于30号外显子的第16号cbEGF结构域，即c.IVS30+1A>G，第3 775位插入碱基A使1 259位GGA>AGG，导致甘氨酸Gly>精氨酸Arg，最终在1 267位形成TGA终止密码子。虽然目前FBN1突变与表型没有可靠的证据，但据文献报道PTC突变与Neonatal MFS关系密切，倾向于引起严重的骨骼畸形和心血管异常，但晶状体脱位的发生率较低[8，18]。PTC突变由于形成不完全的蛋白质，通过显性负效应干扰正常蛋白的聚合或者由于产生大量无活性的蛋白质减少了FBN1的总数量而导致MFS(单倍剂量不足)[8，15]。

1989年问世的PCR-SSCP是一种基于DNA构象差别来检测突变的方法，是目前广泛使用的一种基因突变检测技术。应用PCR-SSCP-DNA测序方法可以检测出MFS患儿FBN1的杂合突变。该方法简便、快速、灵敏，不需要特殊的仪器，具有较高的敏感性，可以发现靶DNA片段中未知位置的碱基突变，经实验证明<300 bp的DNA片段中的单一碱基的变化，90%可被SSCP发现。本研究中3例存在异常电泳带，经DNA测序均发现FBN1突变。与其他基因突变筛选方法相比，虽然其也有不足之处，但是该方法具有灵敏度高、特异性强、成本低廉等优点，能为MFS基因诊断提供依据。

4　结论

本研究发现了2例国内外均未报道的新发突变，1例是新发错义突变，c.2638G>A，位于21号外显子的第2个杂交分子结构域，导致了第879位甘氨酸Gly变为丝氨酸Ser；另1例是新发PTC突变(移码突变)，c.IVS30+1A>G，位于30号外显子的第16号cbEGF结构域，第3 775位插入碱基A使1 259位GGA>AGG，导致甘氨酸Gly>精氨酸Arg，最终在1 267位形成TGA终止密码子，这2种突变可能是MFS的致病原因。

本研究同时发现1例已知Neonatal MFS的错义突变，位于27号外显子的第13号cbEGF结构域，为c.3349T>C，导致第1 117位的半胱氨酸Cys变为精氨酸Arg。

PCR-SSCP-DNA测序方法简便、快速、灵敏，不需要特殊的仪器，具有敏感度高、特异性强、成本低廉等优点，能为儿童MFS基因诊断提供依据，是一种具有广泛前途的检测方法。

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