尤燕舞，杨发奋，林 栩，王 洁

IgA肾病是我国最常见的原发性肾小球疾病，占原发性肾小球疾病的40%以上，大多数患者病程呈慢性进展，是导致终末期肾脏病的最常见病因，肾功能损害是IgA肾病进展的危险因素之一。IgA肾病的发病机制尚不清楚，研究认为遗传因素在IgA肾病的发生发展中起着重要作用[1]。目前仍无针对IgA肾病的特异性治疗，但血管紧张素转化酶抑制剂和血管紧张素受体阻断剂治疗IgA肾病的疗效是得到公认和肯定的。本研究旨在探讨IgA肾病肾功能损害患者肾素-血管紧张素系统(RAS)的3个主要基因，即血管紧张素Ⅱ 1型受体(AT1R)基因A1166C、血管紧张素Ⅰ转化酶(ACE)基因插入/缺失(I/D)和血管紧张素原(AGT)基因M235T的多态性。

1　资料与方法

1.1一般资料选取2010年6月—2012年7月右江民族医学院附属医院和百色市人民医院确诊的IgA肾病患者68例为肾病组，其中男36例，女32例；平均年龄为(33.6±12.5)岁；患者均符合以下诊断标准：出现镜下或肉眼血尿，伴或不伴蛋白尿，肾活检后免疫病理明确IgA或以IgA为主的免疫复合物在肾小球系膜区弥漫沉积，尿蛋白定量56.3～1 628.5 mg/24 h，肾小球滤过率(GFR)48～126 ml/min；排除其他肾小球疾病患者。根据GFR将肾病组分为肾功能损害组4例(GFR<70 ml/min)和无肾功能损害组64例(GFR≥70 ml/min)。选取2012年7月在右江民族医学院附属医院体检且性别、年龄与肾病组患者相似的健康人70例为对照组，其中男34例，女36例；平均年龄为(31.5±10.8)岁，相互间无血缘关系，血常规、血脂及其他生化指标均在参考值范围内，心电图检查正常。

1.2方法

1.2.1基因组DNA提取采集受检者静脉血3 ml，用乙二胺四乙酸盐(EDTA-K2)抗凝，采用改良碘化钠法提取白细胞基因组DNA，-86 ℃冰箱保存备用。

1.2.2AT1R基因A1166C多态性检测采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)。PCR反应引物序列为A1166C-F：5′-CTCATCCACCAAGAAGCCT-3′，A1166C-R：5′-AGAAAAGTCGGTTCAGTCCA-3′。在15.0 μl的反应体系中含50 pmol/μl引物各0.2 μl、1.5 μl的10×buffer、0.3 μl的2.5 Mm dNTP、0.1 μl的5 U Taq酶、1.2 μl MgCl2，在PCR扩增仪上按以下条件进行循环反应：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s、68 ℃退火45 s、72 ℃延伸60 s，20个循环；95 ℃变性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s，20个循环；72 ℃充分延伸6 min，取扩增产物10 μl，37 ℃用DdeⅠ水解过夜。3%琼脂糖凝胶电泳(恒压150 V，电泳液为1×TBE)，溴酚蓝染色30 min后紫外灯下观察结果。

1.2.3ACE基因I/D多态性检测采用直接PCR法，ACE基因第16内含子中存在的缺失(D)和插入(I)多态性表现为缺失纯合子(DD)、插入纯合子(II)以及缺失和插入杂合子(DI)3种基因型。PCR反应引物序列为hACE-F：5′-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3′，hACE-R：5′-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3′。在15.0 μl的反应体系中含50 pmol/μl引物各0.2 μl、1.5 μl的10×buffer、0.3 μl的2.5 Mm dNTP、0.1 μl的5 U Taq酶、1.2 μl MgCl2，在PCR扩增仪上按以下条件进行循环反应：95 ℃预变性300 s，95 ℃变性30 s、68 ℃退火45 s、72 ℃延伸60 s，20个循环；95 ℃变性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s，20个循环；72 ℃充分延伸6 min，取扩增产物10 μl用1.5%琼脂糖凝胶电泳(恒压150 V，电泳液为1×TBE)，溴酚蓝染色30 min后紫外灯下观察结果。

1.2.4AGT基因M235T多态性检测采用PCR-RFLP，PCR反应引物序列为rs699-F：5′-GAAGACTGGCTGCTCCCTCA-3′，rs699-R：5′-TCAGCTACACATTGGATACTAAGTC-3′。在15.0 μl的反应体系中含50 pmol/μl引物各0.2 μl、1.5 μl的10×buffer、0.3 μl的2.5 Mm dNTP、0.1 μl的5 U Taq酶、1.2 μl MgCl2，在PCR扩增仪上按以下条件进行循环反应：95 ℃预变性300 s，95 ℃变性30 s、68 ℃退火45 s、72 ℃延伸60 s，20个循环；95 ℃变性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s，20个循环；72℃充分延伸6 min，取扩增产物10 μl，37 ℃用Hin1Ⅱ酶水解过夜。3%琼脂糖凝胶电泳(恒压150 V，电泳液为1×TBE)，溴酚蓝染色30 min后紫外灯下观察结果。

1.2.5基因测序取不同基因型的酶切产物或PCR产物各30 μl送上海生工生物工程有限公司进行测序，以证实与酶切鉴定的基因型结果是否一致。

1.3统计学方法计算各组AT1R基因A1166C、ACE基因I/D、AGT基因M235T基因型频率，确认其是否符合Hardy-Weinberg平衡公式P2+2Pq+q2=1(P为AA或II或MM基因型频率，q为CC或DD或TT基因型频率，Pq为AC或ID或MT基因型频率)。应用SPSS 16.0统计软件进行分析，计数资料以频数表示，采用χ2检验；以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1基因型频率AT1R基因A1166C、ACE基因I/D、AGT基因M235T基因型频率符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，具有群体代表性。

2.2电泳结果AT1R基因A1166C基因型可见188 bp的等位基因1166A片段(切点消失)，等位基因1166C片段(切点存在)呈130 bp和58 bp两个片段(见图1A)；ACE基因I/D基因型可见D等位基因PCR扩增产物为190 bp，I等位基因PCR扩增产物为490 bp(见图1B)；AGT基因M235T基因型有3种：纯合子MM只见1条173 bp电泳带，纯合子TT可见133 bp和40 bp两条电泳带，杂合子MT可见173 bp、133 bp和40 bp共3条电泳带(见图1C)。

2.3基因型分布肾病组与对照组ACE基因I/D基因型分布比较，差异有统计学意义(P<0.05)；两组AT1R基因A1166C、AGT基因M235T基因型分布比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表1)。

2.4基因测序结果AT1R基因A1166C的AA和CC两种基因型，ACE基因I/D的II、ID、DD 3种基因型，AGT基因M235T的MM、MT、TT 3种基因型基因测序结果采用局域序列对位排列计算工具(BLAST)进行比对后证实一致，见图2。

2.5亚组分析肾功能损害组与无肾功能损害组ACE基因I/D基因型分布比较，差异有统计学意义(P<0.05)；两组AT1R基因A1166C和AGT基因M235T基因型分布比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表2)。

注：A为AT1R基因A1166C电泳图；B为ACE基因I/D电泳图；C为AGT基因M235T电泳图

图1RAS基因多态性电泳图

Figure1Electrophoretic map of RAS genetic polymorphism

注：A为AT1R基因A1166C AA型，B为AT1R基因A1166C CC型；C为ACE基因I/D DD型，D为ACE基因I/D ID型，E为ACE基因I/D II型；F为AGT基因M235T MM型，G为AGT基因M235T MT型，H为AGT基因M235T TT型

图2RAS基因多态性基因测序图

Figure2Gene sequencing diagram of RAS genetic polymorphism

表1　两组AT1R基因A1166C、ACE基因I/D、AGT基因M235T基因型和等位基因分布比较〔n(%)〕

表2　AT1R基因A1166C、ACE基因I/D、AGT基因M235T基因型和等位基因分布的亚组分析

3　讨论

IgA肾病是一种肾小球系膜区IgA沉积或以IgA沉积为主的原发性肾小球疾病，主要病变特点为弥漫性肾小球系膜细胞、基质增生，IgA呈颗粒状或团块状在系膜区或毛细血管壁分布，病变程度轻重不一，如出现肾功能损害，则病情缓慢进展，预后不良。近年来，遗传因素在IgA肾病的发生发展中的作用引起了学者们的重视[2-4]。在众多原发性肾小球疾病的候选基因和位点中，RAS的编码基因是目前研究最多的易感基因。

ACE的主要生理功能是将血管紧张素Ⅰ(AngⅠ)转化为效应肽血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)，在肾脏系统的调节、电解质和容量平衡的维持中起重要作用。ACE基因位于染色体17q23，编码区全长21 kb，包含25个内含子和26个外显子。其中第16内含子中存在I/D多态性。近年来，ACE基因I/D多态性与疾病的相关性已引起学者们的关注[5-6]。一项关于ACE基因I/D多态性与IgA肾病相关性的Meta分析显示，DD基因型和D等位基因与亚洲人和总体人群IgA肾病发病的关系密切，在亚洲人群中DD基因和D等位基因是IgA肾病发病的致病基因，II基因是保护性基因[7]。本研究结果显示，IgA肾病患者ACE基因I/D多态性与健康人之间存在明显差异，与既往研究结果一致。有部分研究推测RAS基因多态性与IgA肾病肾功能损害有关。Huang等[8]在研究IgA肾病所致的终末期肾脏病患者RAS基因多态性时发现，AT1R基因A1166C、ACE基因I/D和AGT基因M235T基因型在IgA肾病组与正常对照组的分布相似，而IgA肾病致终末期肾脏病组与IgA肾病不伴终末期肾脏病组比较，仅ACE基因DD基因型分布明显升高，说明携带DD基因型的IgA肾病患者更易于发生终末期肾脏病。Hsu等[9]发现，IgA肾病肾功能恶化患者DD基因型的分布明显升高，其认为ACE基因I/D多态性与IgA肾病肾功能损害有关。本研究结果显示，IgA肾病肾功能损害患者ACE基因I/D的DD基因型和D等位基因分布较无肾功能损害患者明显升高，与既往研究结果一致[10]，证明ACE基因I/D多态性与IgA肾病肾功能损害有关。

ATlR主要分布于血管、心脏、肾脏、脑和肝脏，是介导维持和升高血压的关键因子AngⅡ的受体，可通过血管收缩促进血管平滑肌细胞增殖和迁移，在维持血压及靶器官损害过程中起着重要作用。AT1R基因位于3号染色体，可编码356个氨基酸，编码区全长1 kb，仅有1个外显子。现已发现AT1R基因有5个多态位点，即T573→C，A1062→G，A1166→C，G1517→T，A1878→G[11]，其中A1166C多态性与肾小球疾病有关，因此，AT1R基因A1166C多态性在肾小球疾病中的遗传标记为肾病学者所关注。Woo等[12]在研究IgA肾病患者AT1R基因A1166C多态性时发现，AT1R基因A1166C多态性与IgA肾病无关。本研究结果显示，IgA肾病患者AT1R基因A1166C多态性与健康人之间无明显差异，且AT1R基因A1166C多态性在肾功能损害与无肾功能损害患者中的分布也无明显差异。

AGT是一种在肝脏合成的球状糖蛋白，其作为肾素底物在调节血压方面发挥着重要作用。AGT基因位于染色体1q42～43，全长12 kb，包含4个内含子和5个外显子，其第2外显子704上的碱基T突变为C，导致AGT第235位的蛋氨酸被苏氨酸替换。黄海东等[13]研究发现，AGT基因M235T多态性与IgA肾病的发病、临床特征、病理特征等均无关。本研究结果显示，IgA肾病患者AGT基因M235T多态性与健康人之间无明显差异，且AGT基因M235T多态性在肾功能损害与无肾功能损害患者中的分布也无明显差异。

综上所述，ACE基因I/D多态性与IgA肾病的发生、出现肾功能损害有关，DD基因和D等位基因是IgA肾病患者发生肾功能损害的易感因素；IgA肾病患者RAS基因多态性除与种族、临床特征、病理特征等有关外，还可能与RAS基因在IgA肾病中的作用机制、遗传学背景等有关。但由于本研究样本量较小，对于IgA肾病高危人群的风险预测还有待于在更大样本、多中心的人群中进一步验证。

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