张子新 , 余陆娇 , 张立敏 , 李莎

法舒地尔对糖尿病合并动脉粥样硬化大鼠心脏结构和功能的影响*

张子新 , 余陆娇 , 张立敏 , 李莎

目的：评价糖尿病合并动脉粥样硬化大鼠应用法舒地尔后心脏结构和功能变化及相关机制。

动脉粥样硬化；糖尿病；心室重构；法舒地尔；血管内皮功能

(Chinese Circulation Journal, 2013,28: 384.)

糖尿病引起的心血管疾病成为糖尿病患者死亡的主要原因。长期血糖控制不佳会损伤血管内皮，加速动脉粥样硬化的进展，增加冠心病、脑血管疾病风险，急性心血管事件发生率显著增高[1]。冠心病和糖尿病有着共同的病理基础——动脉粥样硬化（AS）。大量研究都证实内皮损伤是动脉粥样硬化形成的始动因素，在糖尿病、心血管疾病早期阶段就存在血管内皮功能障碍[2，3]。许多研究发现 Rho 激酶信号通路参与了动脉粥样硬化的发生和发展，在维持血管内皮功能方面有重要作用[4]。法舒地尔作为特异性 Rho 激酶抑制剂，临床上已广泛应用于脑血管疾病的治疗中，并取得一定疗效。但法舒地尔对心血管系统疾病的影响临床研究不多，因果关系不清。本文拟采用糖尿病高脂血症动脉粥样硬化大鼠模型，研究 Rho激酶抑制剂法舒地尔对其心脏结构和功能的影响及可能机制。

1 资料与方法

实验动物及试剂：2012-05 至 2012-11 健康 雄性 Wistar大鼠（体重 200～220g，6～8 周龄，购自辽宁中医药大学动物实验中心），链脲佐菌素（STZ，sigma，USA），盐酸法舒地尔注射液（购自天津红日药业股份有限公司），高脂饲料（每 50kg配方：基础饲料 78.3%，花生油 8%，砂糖 6%，蛋黄粉5%， 胆固 醇 1.5%，胆盐 0.2%， 甲基 硫氧嘧啶 20克，谷氨酸钠 1%。），HE 染色剂，10% 水合氯醛，OneTouchll型血糖仪，超声仪及探头（美国 GE 公司），美国 BioTek 多功能酶标仪，血管性血友病因子（vWF）、内皮素（ET-1）酶链免疫吸附法（ELISA）试剂盒（购自上海继锦化学科技有限公司）。

实验分组及动物模型制备：健康雄性 wistar大鼠 25 只，分为正常对照组 5 只、模型组 10 只、法舒地尔组 10只。整个实验过程中，所有大鼠均在相同实验条件下饲养，其中正常对照组一直给予普通饲料。另外两组大鼠禁食8小时后经尾静脉注射STZ，剂量为 50 mg/kg（STZ 溶于 0.1mmol/L 柠檬酸缓冲液，pH4.5），同时给予维生素 D3注射液以总剂量 60 万IU/kg分 3 天灌胃，期间仍给予普通饲料饲养。3 天后用血糖仪测血糖，空腹血糖大于 16.5 mmol/L，并出现多饮、多尿、多食症状，证实糖尿病模型造模成功。模型组和法舒地尔组在此基础上再连续喂食前述高脂饲料5周，经腹主动脉超声检查有动脉粥样斑块形成，即证实为糖尿病合并动脉粥样硬化大鼠模型成功。其中糖尿病模型成功率 100%，由于高脂喂养过程中大鼠死亡2只，糖尿病合并动脉粥样硬化模型成功率为 90%。成模后模型组给予生理盐水、法舒地尔组给予法舒地尔注射液腹腔注射，剂量 10 mg/（kg·d），共用药治疗 4 周，治疗结束后进行相关超声、生化及病理检测。

高频超声检测：药物治疗4周末，大鼠禁食8 小时，用 10% 水合 氯醛溶液 1ml/kg 腹腔 注射麻醉，给予胸腹部备皮、消毒，固定于仰卧位，四肢连心电监护电极。采用 GE 公司 vivid7 彩色多普勒超声诊断仪，频率 9MHz线阵式探头，测大鼠心脏左心室结构和功能相关指标：舒张末期室间隔厚度(IVSTd)，舒张末期左心室后壁厚度 (LVPWTd)，舒张末期左心室内径 (LVEDd)，收缩末期左心室内径(LVEDs)。左心室质量指数（LVM index, LVMI）的计算公式如下：LVMI(g/m2)=LVM/体表面积 (BSA），其中 LVM=1.05× [(LVEDd+IVSTd+LVPWTd)3-LVEDd3]。大鼠的体表面积应用 Meeh-Rubner 公式[5]，即：A(体表 面 积 m2)=K×W(g)2/3/1000（ 对 于 大 鼠 K=0.91）。用 Teichholtz 校正公式计算左心室射血分数 (LVEF)，V(左 心 室 容 积 )=[7/(2.4+D)]×D3， 其 中 D 为 左 心室内径。根据 LVEDd 和 LVEDs分别求出左心室舒 张 末 容 积 (EDV)和 左 心 室 收 缩 末 容 积 (ESV)，LVEF=(EDV-ESV)/ EDV×100%。

生化检测：超声检测完后所有动物断头法处死动物，即时取血用血糖仪测血糖，再于大鼠腹主动脉取血 5 ml，分离血清冻存待测。采用生化分析法检测实验大鼠血脂，即甘油三酯 (TG)、总胆固醇 (TC)、低密度脂蛋白胆固醇 (LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇 (HDL-C)。 同 时 用 ELISA 法 测 定 vWF 和 ET-1，所有操作按照试剂盒说明书进行。

病理学检测：处死动物后取左心室心肌组织、主动脉全段，用生理盐水冲洗，4%甲醛溶液固定、脱水、石蜡包埋后切片，行 HE 染色，并于40倍光镜下观察细胞组织学改变。

统计学方法：所有数据用 SPSS13.0 软件进行统计分析，本实验数据均为计量资料，采用均数±标准差表示，各因素比较均采用方差分析方法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

各组大鼠高频超声检测结果：超声检测指标结果如表1。模型组与正常对照组比较 IVSTd、LVPWTd、LVEDd、LVEDs、LVMI的值均增大，差异有统计学意义（P＜0.05），而法舒地尔组和正常对照组的差异无统计学意义（P＞0.05）。法舒地尔组与模型组相比，上述 5 项指标明显减小，差异有统计学意义 (P＜0.05)。模型组的 LVEF 与正常对照组和法舒地尔组相比有降低趋势，但三者间差异均无统计学意义 (P＞0.05)。

表1 各组大鼠高频超声检测结果（±s）

生化指标检测：检测结果如表2。模型组的 vWF和 ET-1 的浓度均高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），而法舒地尔组和正常对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。法舒地尔组和模型组相比，两者的 vWF 和 ET-1 值明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。模型组和法舒地尔组的 TG、TC、LDL-C、血糖水平均明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；法舒地尔组与模型组相比，上述指标也显著降低，差异有统计学意义 (P＜0.05)。模型组和法舒地尔组的 HDL-C 值明显低于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；法舒地尔组与模型组相比 HDL-C有升高趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组大鼠生化指标检测结果（±s）

各组大鼠心肌组织、主动脉病理学观察结果：心肌组织病理学检查：正常对照组的心肌纤维纵行排列规则、致密，胞浆深红染，可见闰盘，细胞核清晰、深蓝染，间质无充血、水肿、炎细胞浸润（图1）；模型组的心肌纤维排列疏松、断裂，呈凝固性坏死表现，胞浆染色浅，横纹消失，细胞核空泡状，局部心肌纤维波浪状排列，间质充血（图2）；法舒地尔组的心肌纤维排列较疏松，胞浆染色浅粉红色，呈轻微凝固性坏死，细胞核染色加深，间质充血明显（图3）。

主动脉病理学检查示：正常对照组 (图4)：内皮细胞完整，中膜平滑肌细胞排列整齐，未见泡沫细胞和脂质沉积；模型组 (图5)内膜向内突出，内膜下可见空泡，发生广泛粥糜样改变，外膜下炎性细胞浸润。法舒地尔组 (图6)：内膜增厚减轻，泡沫细胞减少，平滑肌细胞排列紊乱明显改善。证实了动脉粥样硬化模型成功。

图1、2、3 心肌组织 HE 染色 ×40 倍光镜 图4、5、6 主动脉HE 染色 ×40倍光镜

3 讨论

糖尿病引起的心脏改变一般认为与机体代谢紊乱引起的心肌损伤有关，临床上以早期舒张功能减低为特征，研究发现左心室重构是糖尿病心肌损伤发生的结构基础[6,7]，是导致糖尿病患者心力衰竭发生和致死的重要原因。我们的实验结果与此一致，而且糖尿病合并动脉粥样硬化的大鼠模型与临床上糖尿病合并冠心病的情况十分接近，糖尿病合并动脉粥样硬化加速了心肌损伤，左心室重构明显。

许多研究都证实糖尿病高脂饮食大鼠模型会出现动脉粥样硬化，但病变的程度与造模方法密切相关。目前单独的糖尿病模型或动脉粥样硬化模型已较为成熟，但糖尿病合并动脉粥样硬化模型的造模方法却未有统一标准，尤其是在高脂饮食配方和时间长短上各有不同。为了确保造模成功并符合本实验要求，我们在前人的方法[8-10]基础上进行了改良。预实验予以证实，糖尿病模型给予高脂饮食5周，腹主动脉超声可见动脉粥样斑块，血管病理标本光镜下见早期AS改变。

血管内皮在调节血管稳态方面具有重要作用。生理情况下，内皮细胞通过控制血管紧张素 II（AngII）的活性和释放一些舒缩调节因子，如一氧化氮（NO）和 ET-1等，来维持血管舒张状态和较低的氧化应激水平[4]。当血管内皮损伤时，上述调节功能出现失衡，表现为分泌的舒血管的物质减少，缩血管的 ET-1 等增加，及调节的血管活性的因子tPA、AngII减少，促凝因子增加，氧化应激反应增强，导致血管舒缩功能障碍，易形成脂质斑块[11]。Rho/ ROCK 通路主要是通过肌球蛋白轻链的磷酸化和去磷酸化调节血管平滑肌细胞的收缩，因此 ROCK 的过度激活会导致内皮功能受损。许多研究均发现法舒地尔能改善动脉粥样硬化患者的内皮功能，减少动脉斑块，并且该作用与法舒地尔对Rho激酶抑制的 程度 相关[12，13]。vWF 是一 种存 在 于内 皮细胞 表面的糖蛋白，血管内皮细胞是循环中vWF的唯一来源，vWF在调节血小板粘附受损血管内皮的过程中起关键作用。血管内皮受损时 vWF释放显著增加，促进血小板粘附和血栓形成，促进动脉粥样硬化形成。vWF的升高也反映了血管内皮受损情况。本实验显示模型组 ET-1 和 vWF 浓度均升高，法舒地尔治疗组这两项指标均明显下降，接近正常对照组水平，证明法舒地尔改善了模型大鼠的血管内皮功能。

本实验超声检查发现糖尿病合并动脉粥样硬化大鼠出现了明显的心肌肥厚和左心室重构，室间隔、左心室后壁均显著增厚，左心室扩大，尽管心功能未出现有统计学意义的改变，但射血分数也出现了轻度降低趋势。同时病理检查结果也证明模型组大鼠心肌组织已出现了间质水肿、充血，局部已出现了心肌纤维断裂、坏死，出现了心肌纤维化。LVMI是一个评价心室重构变化的重要指标，本实验根据超声检测结果计算得出模型组大鼠 LVMI显著升高，也证明了大鼠出现了左心室重构。

法舒地尔是特异性 Rho激酶抑制剂，通过与ATP 竞争 Rho激酶催化区的 ATP 结合位点而抑制Rho激酶的活性，进而改善血管内皮功能，发挥抗动脉粥样硬化作用[14]。法舒地尔的心脏保护作用可能与其抑制 Rho/ROCK 通路的过度激活有关，研究揭示 ROCK 活性增高和内皮功能受损相关 , 是冠心病动脉硬化发病过程中的重要机制[4]。关于糖尿病的研究也发现高血糖环境会激活 Rho激酶，引起血管内皮受损，Rho/ROCK 通路也参与糖尿病及其并发症的发生发展，内皮功能障碍已成为糖尿病患者合并动脉粥样硬化患者的早期防治的重要靶点[1,15,16]

经过法舒地尔治疗的大鼠与未治疗的大鼠相比， 其 IVSTd、LVPWTd、LVEDd、LVEDs 均 明 显减小，并且 LVMI也显著降低，显示法舒地尔延缓了心脏结构改变和心功能恶化，有明显的心脏保护作用。病理检查也显示法舒地尔组的心肌损伤比模型组大鼠病变减轻。上述各项结果均证实法舒地尔可以抑制心室重构，保护心肌，改善心功能。

另外，本实验还发现法舒地尔能降低糖尿病大鼠的血糖，模型组和法舒地尔组的血糖与正常对照组相比均显著升高，但法舒地尔组与模型组相比有明显降低。有研究报告高剂量的法舒地尔可使糖尿病大鼠的血糖明显下降[17]，其相关机制可能与 Rho激酶抑制剂法舒地尔改善内皮功能和胰岛素抵抗有关，仍有待进一步研究证实。

综上所述，糖尿病合并动脉粥样硬化的大鼠存在心肌损伤，出现左心室重构。法舒地尔可以抑制糖尿病合并动脉粥样硬化大鼠的心室重构，改善心功能。其机制可能与法舒地尔特异性抑制 Rho激酶，改善内皮功能相关。本研究为法舒地尔对糖尿病合并动脉粥样硬化的早期防治提供了重要参考价值，深入的临床观察仍需进行。

[1]Xu J, Zou MH. Molecular insights and therapeutic targets for diabetic endothelial dysfunction. Circulation , 2009, 120: 1266-1286.

[2]Mizuno Y, Jacob RF, Mason RP. Inflammation and the development of atherosclerosis, J Atheroscler Thromb, 2011, 18: 351-358.

[3]Gojo A, Utsunomiya K, Taniguchi K, et al. The Rho-kinase inhibitor, fasudil, attenuates diabetic nephropathy in streptozotocin-induced diabetic rats. European Journal of Pharmacology , 2007, 568: 242-247.

[4]Sitia S, Tomasoni L, Atzeni F, et al. From endothelial dysfunction to atherosclerosis. Autoimmun Rev, 2010, 9: 830-834.

[5]赵伟 , 孙国志 . 不同种实验动物间用药量换算 . 实验动物 , 2010, 5: 52-53.

[6]Deverux RB, Roman MJ, Parancias BA, et al. Impact of diabetes on cardiac structure and function strong heart study. Circulation, 2000, 101: 2271-2276.

[7]李卫虹 , 李昭屏 , 张会欣 , 等 . 左心室壁中层缩短率评价 2 型糖尿病患者早期左心室收缩功能变化 . 中国循环杂志 , 2011, 26: 446-449.

[8]韩静 , 余俊达 , 潘秋 , 等 . 四种高脂饲料诱发胰岛素抵抗的实验研究 . 江西中医学院学报 , 2010, 22: 64-66.

[9]张琪 , 杜宇 , 陈国广 , 等 . 小麦中提取的 A2 淀粉酶抑制剂调节血脂及抗动脉粥样硬化的实验研究．中国药科大学学报 , 2005, 36: 572-576.

[10]路一平 , 邱健 , 詹纯列 . 实验性糖尿病动脉粥样硬化大鼠模型的建立 . 四川动物 , 2006, 25: 165-167.

[11]Sprague AH, Khalil RA. Inflammatory cytokines in vascular dysfunction and vascular disease. Biochemical Pharmacology, 2009, 78: 539-552.

[12]Wu DJ, Xu JZ, Wu YJ, et al. Effects of fasudil on early atherosclerotic plaque formation and established lesion progression in apolipoprotein E-knockout mice. Atherosclerosis, 2009, 207: 68-73.

[13]Nohria A, Grunert ME, Rikitake Y, et al. Rho kinase inhibition improves endothelial function in human subjects with coronary artery disease. Circulation Research, 2006, 99: 1426-1432.

[14]Lai A, Frishman WH. Rho-kinase inhibition in the therapy of cardiovascular disease. Cardiol Rev, 2005, 13: 285-892.

[15]Sharma A, Bernatchez PN, de Haan JB. Targeting endothelial dysfunction in vascular complications associated with diabetes. Int J Vasc Med, 2012, 2012: 750126.

[16]李建军 . 他汀类药物非调脂作用及其机制 . 中国循环杂志 , 2011, 26: 155.

[17]Kikuchi Y, Yamada M, Imakiire T, et al. A Rho-kinase inhibitor fasudil prevents development of diabetes and nephropathy in insulinresistant diabetic rats. J Endocrinol, 2007, 192: 595-603.

Effect of Fasudil on Cardiac Structure and Function in Diabetes-Atherosclerosis Rats

ZHANG Zi-xin, YU Lu-jiao, ZHANG Li-min, LI Sha.
Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang (110001), Liaoning, China

ZHANG Zi-xin, Email: catexin2000@qq.com

Objective: To evaluate the effect of Fasudil on cardiac structure and function in diabetes-atherosclerosis rats with the related mechanism.Methods: A total of 25 Wista rats were randomly divided into 3 groups, Control group, n=5, the rats received normal diet, Model group and Fasudil group, n=10 diabetes-atherosclerosis rats in each group, and the animals respectively received normal saline and fasudil for 4 weeks. By the end of treatment, the echocardiogram, blood levels of vWF, ET-1 and left myocardial tissue pathology were examined and compared among different groups.Results: ① Compared with Control group, Model group had increased end-diastolic inter ventricular septum thickness, end-diastolic left ventricular thickness, left ventricular end-diastolic dimension (LVEDd), LVESd and left ventricular weight index by echocardiogram, all P＜0.05; there were no real differences between Fasudil and Control groups, P＞0.05; while those indicators were lower in Fasudil group than those in Model group, P＜0.05. ② Compared with Control group, Model and Fasudil groups showed higher levels of vWF and ET-1 (P＜0.05 between Model and Control groups, P＞0.05 between Fasudil and Control groups); the above indexes in Fasudil group were lower than those in Model group, P＜0.05. ③ Tissue pathology indicated that myocardial congestion, swelling and necrosis were less severe in Fasudil group than Model group.Conclusion: The diabetes-atherosclerosis rats have myocardial injury and left ventricular remodeling. Fasudil could improve vascular endothelial function, and therefore, play the anti-atherosclerosis role and inhibiting ventricular remodeling.

Atherosclerosis; Diabetes mellitus; Ventricular remodeling; Fasudil; Vascular endothelial function

2013-04-24）

（编辑：汪碧蓉）

辽宁省自然科学基金资助项目（20092109）

110001 辽宁省沈阳市，中国医科大学附属第一医院 心血管内科（张子新、余陆娇 ） 心血管超声科（张立敏、李莎 ）

张子新 副教授 博士 硕士研究生导师 主要研究方向为高血压、冠心病的诊治 Email：catexin2000@qq.com 通讯作者：张子新

R54

A

1000-3614（2013）05-0384-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2013.05.018

方法：25 只 Wistar大鼠分为 3 组，正常对照组 5 只、模型组 10 只、法舒地尔组 10 只。正常对照组给予普通饲料喂养。另两组大鼠采用链脲佐菌素尾静脉注射加高脂饮食制备糖尿病合并动脉粥样硬化模型。成模后再分别给予生理盐水、法舒地尔治疗 4 周。实验末对大鼠进行心脏超声检查，并取血分别检测血管性血友病因子（vWF）、内皮素（ET-1），处死后取左心室心肌组织进行病理学检测。

结果：①超声检查结果示，模型组舒张末期室间隔厚度 ，舒张末期左心室后壁厚度 ，舒张末期左心室内径 ，收缩末期左心室内径，左心室质量指数，均较正常对照组增大（P＜0.05），而法舒地尔组与正常对照组无统计学意义（P＞0.05)；法舒地尔组与模型组比较，上述指标均明显降低 (P＜0.05)。②生化检验示模型组和法舒地尔组大鼠的vWF、ET-1 水平高于正常对照组 (模型组比正常对照组 P＜0.05，而法舒地尔组与正常对照组无统计学意义 P＞0.05)；法舒地尔组与模型组比较，上述指标均明显降低 (P＜0.05)。③病理学结果示模型组大鼠心肌组织出现水肿、间质充血、坏死；法舒地尔组心肌病变较模型组减轻。

结论：糖尿病合并动脉粥样硬化大鼠存在心肌损伤，左心室重构。法舒地尔通过改善内皮功能，抗动脉粥样硬化，抑制心室重构。