张东勇 仇波 王运杰

胶质瘤治疗的新靶点：TGF-β2

张东勇 仇波 王运杰★

胶质瘤是原发于颅内预后较差的肿瘤，尤其是胶质母细胞瘤，其中位生存期不到1年半。目前针对于胶质瘤的治疗包括手术治疗、放射治疗、化疗，新兴的免疫治疗也逐渐获得临床医生的认可。转化生长因子-β2在胶质瘤的免疫过程中起到了非常重要的作用。本文主要阐述TGF-β2在胶质瘤中的作用及未来治疗策略，从而为治疗胶质瘤提供新的治疗途径。

胶质瘤；TGF-β2；免疫治疗

颅内肿瘤包括由脑实质发生的原发性脑肿瘤和由身体其他部位转移至颅内的继发性肿瘤。其中，胶质瘤是颅内发病率最高且预后较差的原发性肿瘤。在成人中，最常见的恶性脑肿瘤是多形性胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM），也是恶性程度最高的颅内原发性肿瘤，中位生存时间只有14.6个月，2年存活率只有26.5%[1]。在过去的十年中，尽管传统的治疗方法包括手术切除，放疗和化疗在不断进步，脑胶质瘤的发病率和死亡率几乎没有变化。免疫治疗作为另一种治疗胶质瘤的手段已经应用很久，然而到目前为止，治疗效果欠佳[2~4]。尽管胶质瘤表达被人体免疫系统所识别的肿瘤相关及特异性抗原，但是胶质瘤细胞可以通过改变肿瘤细胞的微环境从而抑制免疫反应。胶质瘤的免疫抑制机制十分复杂。免疫抑制因子由胶质瘤细胞释放进入细胞周围微环境，并能进入体循环影响机体的免疫效应细胞（如CD8+细胞毒性T细胞，巨噬细胞等）从而抑制免疫系统。其中，转化生长因子-β2（transforming growth factor-β，TGF-β）发挥了极其重要的作用。

1 TGF-β简介

TGF-β是一个多功能的多肽细胞因子，在细胞形态、增殖、分化、胚胎发育、血管生成等方面起到了重要的作用，而且它在人体免疫系统调节中起到非常关键的作用[5]。在哺乳动物组织中TGF-β有三种亚型：TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3；每一种亚型都是由特定的基因编码，而且三种基因的编码序列80%以上都是相同的。在胚胎发生过程中，所有的TGF-β都有表达。在正常成人组织中TGF-β1是主要亚型，而TGF-β2和TGF-β3基本不表达[5]。TGF-β在所有类型的细胞中均以无活性形式合成与分泌，活化后才能与受体结合并表现出生物学活性。活化前的TGF-β包括TGF-β同源二聚体、潜态相关性多肽（latency-associated protein，LAP）与潜态TGF-β结合蛋白（latent TGF-β binding protein，LTBP）[6]。TGF-β通过与其受体结合，诱导受体活化，并通过细胞内与活化受体级联的信号传导分子的激活而发挥其生物学作用。

在现有的研究中发现，TGF-β共有三个不同的受体[7]。由于TGF-β受体在哺乳动物各组织中均有不同程度上的表达，因此TGF-β会依据其表达水平而产生不同的作用。TGF-β通过在其效应细胞表面形成TGF-β I和II型受体的异源二聚体，相继激活TGF-βII受体磷酸化激酶使TGF-β I受体磷酸化，进一步激活TGF-β I受体。当TGF-β I受体激活后，下游分子Smad2和Smad3与TGF-β I受体发生磷酸化，而Smad4则被活化的TGF-β I受体间接激活，激活的Smad2、Smad3和Smad4聚集成共同复合体或形成数个异源二聚体复合物。其中Smad4是最关键和共同的信号传导分子，所有的其他分子均通过与其结合后，才能转入核内诱导靶基因转录[8]。因此，针对于不同的肿瘤细胞，我们首先要了解其表达哪种TGF-β及其受体，从而才能选择靶向通路抑制其表达来抑制肿瘤的发展。TGF-β1和TGF-β2在脑肿瘤的发生和进展中起到了关键作用；尤其是TGF-β2，在高级别胶质瘤中发挥了极其重要的作用。

2 TGF-β信号传导通路

在细胞中，TGF-β主要通过Smad蛋白家族将激活的受体复合物信号向细胞内进行信号传导。Smad是细胞内信号传递通路中的胞浆递质，它可以调节细胞生长、分化。Smad由配体结合的跨膜受体激活，随机通过细胞质进入细胞核，在细胞核中作为转录因子激活TGF-β基因的表达。

TGF-β首先与TGF-β II受体结合，然后两者形成的复合物与TGF-β I受体结合并激活相应的激酶。激活的TGF-β I受体与Smad（TR-Smad）形成异源二聚体，接下来在Smad4的调节下，通过将细胞外的信息转入到细胞核来编码特异的基因。而Smad6和 Smad7可以抑制该信号通路。TGF-β I受体的激活还需要一些补充因子，例如SARA（Smad Anchor for Receptor Activation）。SARA包含Smad蛋白结合域（Smad-binding domain，SBD），同时还包括Smad2、Smad3、C-末端及TGF-β受体相互作用的区域[9]。因此，SARA在TR-Smad磷酸化过程中起到了关键作用。

除了Smad通路，TGF-β还可以通过 Ras-Raf-Er-丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）, 磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）-Akt，JNK 和p38-MAPK通路。这些受体可以活化非Smad通路，既可以单独调节Smad信号来实现细胞对TGF-β的反应，还可以联合Smad蛋白控制Smad蛋白活性。通过协调直接激活Smad蛋白和激活MAPK途径，可以协调细胞对TGF-β的反应[8]。通常，Smad通路与其他通路决定了肿瘤细胞对TGF-β的反应，因此干扰TGF-β信号通路传导可以影响肿瘤细胞的生物学行为。

3 TGF-β2在胶质瘤中的作用

TGF-β2既可以抑制肿瘤基因表达，还可以促进肿瘤基因表达。如果我们利用好这种双重作用，那么它在癌症的治疗中将是有益的抑制剂。在上皮细胞中，TGF-β调节细胞的增殖、分化、细胞形态及细胞与细胞之间基质的粘附。TGF-β对B细胞、NK细胞、巨噬细胞、小胶质细胞和树突状细胞均有抑制作用；除此之外TGF-β还可以抑制T细胞的增殖、分化和激活，从而充当白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2）的功能性拮抗剂。一般来说，TGF-β对在不同的细胞类型中主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）II类抗原的表达起负向调节作用，这其中也包括神经胶质瘤细胞[10,11]。然而，在恶性胶质瘤细胞中，尽管TGF-β2的激活通路没有改变，但是其抑制细胞增殖的能力却消失了[7,12]。除此之外，TGF-β2还是重要的免疫抑制因子，肿瘤细胞可以分泌TGF-β2影响肿瘤周围的微环境，从而限制了胶质瘤的免疫治疗。通过抑制T细胞和B细胞的激活和增殖，TGF-β2可以影响自然杀伤细胞的活力和降低IL-2、IL-6、IL-10、IFN-γ等细胞因子的表达[13]。

在众多肿瘤组织中，TGF-β的分泌要明显高于相应的正常组织[14,15]，而且TGF-β的表达程度与肿瘤预后密切相关[16]。TGF-β2在恶性胶质瘤中高度表达，它的高水平表达与患者免疫缺陷状态、疾病的阶段有关[17]。约30年前，研究者在人胶质瘤细胞系LN-308上清液中发现TGF-β2是免疫抑制相关因子[18]。TGF-β2能够促进脑胶质瘤血管形成，增加肿瘤侵袭能力、抑制T细胞介导的免疫反应[13]。在体内，TGF-β可能对胶质瘤细胞增殖没有太大影响，但它与胶质瘤细胞的运动与侵袭密切相关。Schneider等[12]研究发现，胶质母细胞瘤患者血浆中TGF-β1和TGF-β2的表达水平明显高于健康对照组。经过手术后，血浆中TGF-β2的表达水平明显降低。TGF-β1和TGF-β2通过诱导整联蛋白（integrin）αV和整联蛋白β3的表达，促进胶质瘤细胞的运动和迁移[19,20]。Wick等[21]研究证实TGF-β2可以通过MMP-2促进胶质瘤细胞侵袭。在我们最近的研究中发现，TGF-β2不仅可以促进胶质瘤细胞的侵袭力，而且还可以促进胶质瘤的祖细胞－胶质瘤干细胞的侵袭力[22]。Penuelas等[23]发现TGF-β2可以诱导胶质瘤干细胞的自我更新并能阻止分化。在胶质瘤干细胞中，TGF-β2的高表达被认为是胶质瘤干细胞逃避免疫系统监视的主要因子[24]；同时，胶质瘤干细胞能够通过迁移逃避传统方法的治疗[25]。TGF-β2不仅能够抑制淋巴细胞的增殖，还能在多方面影响机体的免疫系统。这些作用包括抑制免疫细胞激活来阻断抗肿瘤行为、抑制抗原提呈、影响细胞因子平衡从而向免疫抑制方向发展。因此，有针对性地抑制TGF-β2可以抑制它的阻碍抗肿瘤作用，恢复免疫细胞介导的对胶质瘤细胞的细胞毒性[26,27]。

4 抑制胶质瘤TGF-β2的策略

4.1 反义（Antisense）策略

TGF-β2在胶质瘤的生长、侵袭，血管形成，尤其是免疫抑制等方面起到了至关重要的作用，因此针对于TGF-β2的治疗策略现在也是胶质瘤的研究热点。在过去的十多年中，TGF-β2反义寡核苷酸被用来抑制TGF-β2的合成，从而影响神经胶质瘤细胞的免疫介导[28]。在9L大鼠脑胶质瘤细胞模型中，TGF-β1反义基因转染的神经胶质瘤细胞种植于大鼠皮下可以抑制颅内肿瘤的生长；同时，还能赋予大鼠一定的保护性免疫[29]。同样地，TGF-β2反义转染的C6胶质瘤细胞，注入小鼠颅内，与对照组相比，其生存时间明显延长[30]。Trabedersen（AP12009）是一种反义寡核苷酸，它的序列可以完全针对人类TGF-β2 mRNA，抑制TGF-β2蛋白表达[27,31]。Trabedersen通过增强对流输送（convection-enhanced delivery，CED）方法可以送到颅内治疗靶点[9]；目前，一部分高级别星形细胞瘤患者正在进行I/II期临床试验，一部分间变型星形细胞瘤患者在进行III期临床试验。迄今为止临床前期试验和临床试验取得的结果是令人鼓舞的，trabedersen不仅可以延长癌症患者的生存时间，而且副作用非常小[27]。

4.2 药物抑制TGF-β2合成

到目前为止，TGF-β特效的直接抑制剂还没有发现。然而在实验研究中发现，一部分药物可以抑制TGF-β的表达。曲尼司特（tranilast）可以抑制成纤维细胞和平滑肌细胞中TGF-β合成。这一现象在体外培养的胶质瘤细胞中也得到了证实：曲尼司特通过抑制TGF-β抑制胶质瘤细胞的增殖和迁徙[32]。我们的实验中发现，与对照组相比，替莫唑胺可以抑制胶质瘤干细胞TGF-β2 mRNA的表达，通过酶联免疫吸附剂测定方法，我们发现替莫唑胺还可以抑制细胞培养基中的TGF-β2 蛋白表达[22]。

4.3 抑制TGF-β2信号通路

为了抑制TGF-β2活性，我们不仅要针对宿主细胞，还要针对肿瘤细胞。例如可以针对经典的Smad通路进行调节，或者对MAPK、PI3K-Akt、JNK 及p38-MAPK通路等进行调节；Tritschler等发现潜态TGF-β结合蛋白1（LTBP-1）在TGF-β2-Smad信号通路中发挥重要的调节作用，提示其可以作为TGF-β2信号通路抑制的重要靶点[33]；此外，Grzmil等[34]也发现MAP激酶相互作用丝/苏氨酸激酶1（MKNK1，又名MNK1）可以调节胶质母细胞瘤中TGF-β2-Smad信号通路的翻译过程，提示可以针对其进行相应的生物治疗。还有报道针对胶质瘤细胞的TGF-β2受体进行信号通路的调节研究，与TGF-β2形成竞争，从而降低TGF-β2活性，如Uhl等[35]证实SD-208可以抑制TGF-β I型受体信号通路从而影响胶质瘤细胞的迁徙和侵袭。

5 展望

如何选择一个合适的目标被证明是确定候选药物治疗疾病成功或失败的关键步骤。一个最佳的肿瘤细胞靶向分子在促进肿瘤生长和疾病进展中起到了重要作用。由于TGF-β2不仅在胶质瘤免疫反应中起到关键作用，而且在胶质瘤的迁徙、侵袭及血管形成等方面作用同样举足轻重，因此TGF-β2被认为是治疗胶质母细胞瘤最有前途的靶向分子。日益增加的前期临床试验和临床数据说明针对TGF-β2的治疗是一种有效的治疗高级别胶质瘤的方式，而且TGF-β2还可以作为针对胶质瘤干细胞的分子靶向通路。种类繁多的TGF-β2小分子抑制剂目前正在开发中。TGF-β2的几种拮抗策略已经成功地在体外和体内动物模型中完成，包括反义策略、抑制TGF-β合成等策略。尤其是Trabedersen，目前已经应用到临床实验中，相信在不久的将来，TGF-β2会为我们打开治疗胶质瘤的又一扇大门。

[1] Stupp R, Mason W P, van den Bent M J, et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma[J]. N Engl J Med, 2005, 352(10): 987-996.

[2] De Vleeschouwer S, Fieuws S, Rutkowski S, et al. Postoperative adjuvant dendritic cell-based immunotherapy in patients with relapsed glioblastoma multiforme[J]. Clin Cancer Res, 2008, 14(10): 3098-3104.

[3] Sampson J H, Archer G E, Mitchell D A, et al. An epidermal growth factor receptor variant III-targeted vaccine is safe and immunogenic in patients with glioblastoma multiforme[J]. Mol Cancer Ther, 2009, 8(10): 2773-2779.

[4] Fadul C E, Fisher J L, Gui J, et al. Immune modulation effects of concomitant temozolomide and radiation therapy on peripheral blood mononuclear cells in patients with glioblastoma multiforme[J]. Neuro Oncol, 2011, 13(4): 393-400.

[5] Massagué J. TGF β signalling in context[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2012, 13(10): 616-630.

[6] Todorovic V, Rifkin D B. LTBPs, more than just an escort service[J]. J Cell Biochem, 2012, 113(2): 410-418.

[7] Kaminska B, Kocyk M, Kijewska M. TGF beta signaling and its role in glioma pathogenesis[J]. Adv Exp Med Biol, 2013, 986: 171-187.

[8] Nagaraj N S, Datta P K. Targeting the transforming growth factor-beta signaling pathway in human cancer[J]. Expert Opin Investig Drugs, 2010, 19(1): 77-91.

[9] Massagué J, Seoane J, Wotton D. Smad transcription factors[J]. Genes Dev, 2005, 19(23): 2783-2810.

[10] De Miguel M P, Fuentes-Julián S, Blázquez-Martínez A, et al. Immunosuppressive properties of mesenchymal stem cells: advances and applications[J]. Curr Mol Med, 2012, 12(5): 574-591.

[11] Reiss M. TGF-beta and cancer[J]. Microbes Infect, 1999, 1(15): 1327-1347.

[12] Schneider T, Sailer M, Ansorge S, et al. Increased concentrations of transforming growth factor beta1 and beta2 in the plasma of patients with glioblastoma[J]. J Neurooncol, 2006, 79(1): 61-65.

[13] Hau P, Jachimczak P, Schlaier J, et al. TGF-β2 signaling in high-grade gliomas[J]. Curr Pharm Biotechnol, 2011, 12(12): 2150-2157.

[14] Connolly E C, Freimuth J, Akhurst R J. Complexities of TGF-β targeted cancer therapy[J]. Int J Biol Sci, 2012, 8(7): 964-978.

[15] Ikushima H, Miyazono K. Biology of transforming growth factor-β signaling[J]. Curr Pharm Biotechnol, 2011, 12(12): 2099-2107.

[16] Bruna A, Darken R S, Rojo F, et al. High TGFbeta-Smad activity confers poor prognosis in glioma patients and promotes cell proliferation depending on the methylation of the PDGF-B gene[J]. Cancer Cell, 2007, 11(2): 147-160.

[17] Kjellman C, Olofsson S P, Hansson O, et al. Expression of TGF-beta isoforms, TGF-beta receptors, and SMAD molecules at different stages of human glioma[J]. Int J Cancer, 2000, 89(3): 251-258.

[18] Fontana A, Hengartner H, de Tribolet N, et al. Glioblastoma cells release interleukin 1 and factors inhibiting interleukin 2-mediated effects[J]. J Immunol, 1984, 132(4): 1837-1844.

[19] Platten M, Wick W, Wild-Bode C, et al. Transforming growth factors beta(1) (TGF-beta(1)) and TGF-beta(2) promote glioma cell migration via Up-regulation of alpha(V) β(3) integrin expression[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2000, 268(2): 607-611.

[20] Mamuya F A, Duncan M K. aV integrins and TGF-βinduced EMT: a circle of regulation[J]. J Cell Mol Med, 2012, 16(3): 445-455.

[21] Wick W, Platten M, Weller M. Glioma cell invasion: regulation of metalloproteinase activity by TGF-beta[J]. J Neurooncol, 2001, 53(2): 177-185.

[22] Zhang D, Jing Z, Qiu B, et al. Temozolomide decreases invasion of glioma stem cells by down-regulating TGF-β2[J]. Oncol Rep, 2011, 26(4): 901-908.

[23] Peñuelas S, Anido J, Prieto-Sánchez R M, et al. TGF-beta increases glioma-initiating cell self-renewal through the induction of LIF in human glioblastoma[J]. Cancer Cell, 2009, 15(4): 315-327.

[24] Qiu B, Zhang D, Wang C, et al. IL-10 and TGF-β2 are overexpressed in tumor spheres cultured from human gliomas[J]. Mol Biol Rep, 2010, 38(5): 3585-3591.

[25] Ji J, Black K L, Yu J S. Glioma stem cell research for the development of immunotherapy[J]. Neurosurg Clin N Am, 2010, 21(1): 159-166.

[26] Paul D B, Kruse C A. Immunologic approaches to therapy for brain tumors[J]. Curr Neurol Neurosci Rep, 2001, 1(3): 238-244.

[27] Jaschinski F, Rothhammer T, Jachimczak P, et al. The antisense oligonucleotide trabedersen (AP 12009) for the targeted inhibition of TGF-β2[J]. Curr Pharm Biotechnol, 2011, 12(12): 2203-2213.

[28] Hau P, Jachimczak P, Bogdahn U. Treatment of malignant gliomas with TGF-beta2 antisense oligonucleotides[J]. Expert Rev Anticancer Ther, 2009, 9(11): 1663-1674.

[29] Fakhrai H, Dorigo O, Shawler D L, et al. Eradication of established intracranial rat gliomas by transforming growth factor beta antisense gene therapy[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1996, 93(7): 2909-2914.

[30] Liau L M, Fakhrai H, Black K L. Prolonged survival of rats with intracranial C6 gliomas by treatment with TGF-beta antisense gene[J]. Neurol Res, 1998, 20(8): 742-747.

[31] Vallieres L. Trabedersen, a TGFbeta2-specific antisense oligonucleotide for the treatment of malignant gliomas and other tumors overexpressing TGFbeta2[J]. IDrugs, 2009, 12(7): 445-453.

[32] Platten M, Wild-Bode C, Wick W, et al. N-[3,4-dimethoxycinnamoyl]-anthranilic acid (tranilast) inhibits transforming growth factor-beta relesase and reduces migration and invasiveness of human malignant glioma cells[J]. Int J Cancer, 2001, 93(1): 53-61.

[33] Tritschler I, Gramatzki D, Capper D, et al. Modulation of TGF-beta activity by latent TGF-beta-binding protein 1 in human malignant glioma cells[J]. Int J Cancer, 2009, 125(3): 530-540.

[34] Grzmil M, Morin P Jr, Lino M M, et al. MAP kinaseinteracting kinase 1 regulates SMAD2-dependent TGF-βsignaling pathway in human glioblastoma[J]. Cancer Res, 2011, 71(6): 2392-2402.

[35] Uhl M, Aulwurm S, Wischhusen J, et al. SD-208, a novel transforming growth factor beta receptor I kinase inhibitor, inhibits growth and invasiveness and enhances immunogenicity of murine and human glioma cells in vitro and in vivo[J]. Cancer Res, 2004, 64(21): 7954-7961.

The new target of glioma treatment: TGF-β2

ZHANG Dongyong, QIU Bo, WANG Yunjie★
(Department of Neurosurgery, The First Aff i liated Hospital of China Medical University, Liaoning, Shenyang 110001, China)

Gliomas are primary intracranial tumors in poor prognosis, especially high grade gliomas such as glioblastoma multiformes. The median survival of gliomas is merely less than 1.5 years. The treatments of glioma include surgery, radiation therapy, chemotherapy, and immunotherapy are gradually recognized by clinicians. Transforming growth factor-β2 plays a very important role in glioma immune process. This review focuses on the role of TGF-β2 in glioma and future treatment strategies, and thus provides a new therapeutic approach for the treatment of glioma.

Glioma; TGF-β2; immunotherapy

中国医科大学附属第一医院神经外科，辽宁，沈阳 110001

★通讯作者：王运杰，E-mail:wyj024@vip.sina.com