余娟平张琼徐伟文★李明,2

•综 述•

Glypican-3的血清检测与原发性肝癌诊断的研究进展

余娟平1张琼1徐伟文1★李明1,2

磷脂酰肌醇蛋白多糖-3（glypican-3, GPC3）是继AFP之后发现的一个新的肝细胞癌标志物。随着对GPC3研究的不断深入，发现它不但在肝细胞癌组织中有表达而且在血清中同样有表达。GPC3对HCC诊断的敏感性和特异性较高，尤其在肿瘤发生的早期，具有极大的临床应用价值，为早期HCC的诊断带来了希望。

磷脂酰肌醇蛋白多糖-3；肝细胞癌；诊断

肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，是我国位居第二的癌症“杀手”，其恶性程度高，病情进展快[1]。据美国癌症协会统计显示，在肝癌中肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）约占75%，是最常见的肝脏原发性恶性肿瘤。在我国原发性肝癌中肝细胞癌占90% ，病人早期无明显症状，一旦出现症状就诊，往往已属中晚期，5年生存率低于10%～15%[2]。

目前，对于小肝癌的早期发现和诊断，肿瘤标志物检测方便、快捷，具有优势。国家食品药品监督管理局（SFDA）发布的《肿瘤标志物类定量检测试剂注册申报资料指导原则》中指出，理想的肿瘤标志物应具有以下特性：特异性好，便于良、恶性肿瘤的鉴别；与病情严重程度、肿瘤大小或分期有直接关系；检测治疗效果，肿瘤标志物浓度增高或降低与治疗效果相关；预测复发，疾病复发时肿瘤标志物水平明显异常。近期的国内外研究显示, glypican-3（GPC3）在人类HCC组织及血清中有显著的表达，尤其是在AFP阴性的HCC中GPC3亦有表达。其对原发性肝癌的诊断具有较高的敏感性和特异性，与肝癌的发生、发展关系密切[3]。血清中GPC3的测定作为HCC的诊断，特别是早期诊断、鉴别诊断、转移复发及治疗效果评价等方面具有重要价值。本文就GPC3在HCC血清学方面的研究进展作一概述。

1 GPC3的结构

GPC3于1996年被Pillia在研究Simpson-Golabi-Behmel综合症（SGBS）时从人胚胎中发现[4]。GPC3基因定位在人染色体Xq26[5]，其基因组结构全长大于900 kb，是人类基因组中最大的基因之一。该基因5'端朝向端粒区，3'端朝向中心粒区，由8个外显子和7个内含子组成。启动子区有许多转录因子结合位点。编码的GPC3蛋白前体为580个氨基酸残基的蛋白质，分子量约为66 kDa。GPC3是Glypican家族的一员，其结构具有Glypican家族的共同特点，如中央球状结构空间、C端糖胺聚糖侧链连接位点等。GPC3基本结构包含核心蛋白、硫酸乙酰肝素链和糖基化磷脂酰肌醇。GPC3的核心蛋白下游富含半胱氨酸结构区的下端，即第358位精氨酸和359位丝氨酸处可被酶切割成两段，使N-端约含40 kDa的GPC3蛋白成为可溶性蛋白片段（sGPC3）而分泌入血[6]。

2 GPC3在肝癌诊断中的价值

近年来国内外的研究基本上都一致认为GPC3是原发性肝癌的特异性标志物，具有理想肿瘤标志物的特性，对诊断HCC有较高的敏感性和特异性。在AFP阴性的HCC中，GPC3呈阳性表达。因此，联合检测GPC3和AFP可以大大提高HCC的早期检出率。

2.1 GPC3在HCC组织中的表达

Wang等[7]发现GPC3在HCC病人的组织中阳性率为83.4%（45/54）,而在其他良性肝病、肝转移瘤和肝胆管细胞癌中均呈阴性。Capurro等[8]研究显示GPC3在HCC病人组织中阳性率为72%（21/29）,在正常及良性肝病组织中未见表达，此结果与Wang F H等的结果基本一致。Llovet等[9]报道在丙型肝炎肝硬化背景下的早期肝癌组织（＜ 2 cm结节）中GPC3的表达为100%阳性，而在其他良性肝病和正常肝组织中为阴性。Sha fi zadeh等[10]研究显示GPC3在鉴别低分化HCC时敏感性较高。这些研究都表明GPC3是原发性肝癌的一种特异标志物。

2.2 原发性肝癌患者血清中GPC3的表达

GPC3通过糖基磷脂酰肌醇锚定于细胞膜表面，但其第358位精氨酸和359位丝氨酸处可被酶切割，产生的N末端片段可入血被检测到，这对于临床检测来说是一个福音。多项研究表明GPC3不仅可以在血清中被检测到，而且具有较高的阳性检测率和特异性，同时与AFP相比是一个独立的标志物，GPC3与AFP的联合检测可明显提高HCC的诊断敏感性。

Yao等[11]研究显示在HCC患者中，组织GPC3 mRNA、组织GPC3及血清GPC3阳性率分别为100%、100%、77.8%。Capurro M等[8]将血清GPC3检测结果与癌组织阳性率进行比较，结果显示血清GPC3阳性率为53%（18/34）略低于组织阳性率72%，血清GPC3的测值范围在150～3 000 ng/mL，正常人（0/53）和肝炎病人（0/18）血清GPC3测值均为阴性。在20例肝炎肝硬化病人中仅有一例血清GPC3测值为117 ng/mL，显示有所升高。统计结果显示，HCC组GPC3水平与正常人、肝炎及肝硬化三组有显著差异；正常人、肝炎及肝硬化三组之间无显著差异。同时进行AFP检测，结果显示HCC血清阳性率为59%（20/34），患者血清GPC3与AFP水平没有直接关系（P=0.5），联合检测结果显示HCC阳性率提高到82%。周伟等[12]用ELISA法对364例HCC、96例慢性乙肝、106例正常人血清进行GPC3定量，结果显示血清GPC3平均浓度为：HCC患者86.96±422 ng/mL，慢性乙肝11.7±12.23 ng/mL，正常人6.04±9.21 ng/mL。以30 ng/mL为诊断界值，GPC3诊断HCC的敏感性和特异性分别为40%和93%。其同时检测HCC患者血清中AFP值，结果AFP的阳性率为49%。联合检测AFP和GPC3时HCC阳性率提升至72%。Hippo等[13]用ELISA夹心法检测HCC患者、肝硬化、正常人的血清可溶性GPC3含量，结果显示HCC组GPC3为4.84±8.91 ng/mL，肝硬化组为1.09±0.74 ng/mL，正常人组为0.65±0.32 ng/mL。三组之间有显著差异。在分化良好和中度分化的HCC中，GPC3检测的敏感性优于AFP。GPC3和AFP联合检测时，其敏感性从50%提升到72%。

Zhang等[14]用免疫放射法检测血清GPC3水平，其灵敏度达到0.5 ng/mL，与HCC相关的其他标志物如AFP、CA19-9、CEA及PSA无交叉反应。其分析了正常人血清和HCC患者血清中GPC3水平，确定诊断界值为3.1 ng/mL。在HCC发生的早期即可检测到血清GPC3有所增长。HCC患者血清GPC3均值为116.8±98.6 ng/mL，明显高于正常人（0.86±1.12 ng/mL，P＜0.05）、乙肝（6.73±12.2 ng/mL, P＜ 0.05）、丙肝（13.67±15.08 ng/mL, P＜ 0.05）和肝硬化患者（24.6±24.01 ng/mL, P＜ 0.05）。HCC患者的血清GPC3是正常人的100倍，是肝硬化患者的50倍。因此认为血清GPC3水平能很好的区分HCC与其他良性肝病。该实验结果显示GPC3的诊断敏感性是91.7%，AFP为41.7%，CA19-9为30.5%，AFP与CA19-9联合检测为55.5%。可见，AFP与CA19-9联合检测的敏感性没有大的改善，GPC3检测的特异性（100%）明显高于AFP、CA19-9和AFP/CA19-9，GPC3显示出高的敏感性和特异性。

El-Shenawy等[15]最新研究显示血清GPC3水平在HCC病人、肝硬化病人和正常对照三组之间有显著的差异。通过受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲线得出HCC病人与肝硬化病人的最适诊断界值为19 ng/mL，达到敏感性63.5%、特异性70%；肝硬化病人与正常人的最适诊断界值为0.5 ng/mL，达到敏感性90%、特异性80%。

从以上研究结果可见，GPC3在HCC患者血清中有特异性高表达，可很好地鉴别HCC与其他良性肝病如慢性肝炎、肝硬化等。各个研究结果均显示HCC患者血清中GPC3水平明显高于肝硬化、慢性肝炎及正常人。但我们同时也发现，不同研究方法检测得到的血清范围存在明显差异，检测灵敏度也各异，即使使用相同的方法如ELISA法，每个研究者所检测到的HCC中GPC3血清值相差甚大，如周伟等的检测值与Hippo等的检测值相差37倍。除去可能的人群差异之外，实验室检测标准品、质控品、检测方法等没有统一的标准是问题的关键，也是临床检测试剂得以应用必须解决的环节。对于GPC3这样一个具有良好潜力和应用前景的标志物，研发应用于临床的、可靠的检测方法和试剂盒是目前需解决的问题和方向之一。

2.3 血清GPC3对原发性肝癌的早期诊断及鉴别诊断

Liu等[16]对75名HCC患者和32名肝硬化患者进行研究，结果显示AFP对早期HCC的诊断阳性率明显低于GPC3。75名HCC患者按巴塞罗那临床肝癌分期系统进行分期，其中A期14人，B期23人，C期16人，D期22人。以AFP 400 ug/L为诊断界值，结果显示14名A期HCC患者血清中AFP水平均＜ 400 ug/L，阳性率为0%（0/14），B期中阳性率为30.4%（7/23），C期和D期的阳性率为55.3%。同样检测这四期患者血清中GPC3值，根据ROC曲线确定血清GPC3诊断界值值为300 ng/L。检测结果显示，14名A期HCC患者血清GPC3阳性率为50%（7/14）, B期中阳性率为39.1%（9/23）。在这16例血清GPC3值＞ 300 ng/L的患者中仅有3例血清AFP＞ 400 ug/L。对临床诊断为肝硬化的32例患者分别进行血清AFP和GPC3测值，结果显示AFP＞400 ug/L有2例，GPC3＞ 300 ng/L有3例。据此，Liu等[16]认为GPC3是早期HCC敏感特异的标志物，联合检测GPC3和AFP将大大提高HCC各个阶段的诊断敏感性。

Tangkijvanich等[17]用ELISA法研究100例原发性肝癌病人的血清GPC3表达情况，阳性率为53%，GPC3血清值在35.5～7 826.6 ng/mL之间。而50例胆管细胞癌和50例转移癌病人血清GPC3均为阴性。Ligato等[18]用ELISA法研究7例腺瘤、24例原发性肝癌、17例转移性肿瘤、1例局灶性结节性增生患者血清GPC3的表达水平。结果显示所有腺瘤和局灶性结节性增生患者中GPC3均为阴性，转移性恶性肿瘤中有一例是来历不明的具有神经内分泌功能的未分化癌为阳性，其余16例均为阴性。Wang 等[19]研究显示GPC3是诊断HCC的有效标志物，可用于鉴别诊断肝细胞腺瘤与分化良好的HCC； GPC3的血清水平的变化能预测一些肝硬化结节恶变的可能，认为其可能为肝组织癌变的早期标志物。

因此，GPC3被认为是原发性肝癌早期特异的标志物，是区别原发性肝癌与其他良性和恶性肝肿瘤及转移病灶的特异肿瘤标志物。

2.4 肝癌血清中AFP与GPC3表达的相关性

Lü等[20]用反转录-聚合酶连锁反应法（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）研究AFP阴性及阳性的原发性肝癌病人GPC3的表达情况，结果显示在AFP阴性和阳性病人中GPC3的阳性率分别为90%和90.9%，提出GPC3的表达和AFP无明显相关，GPC3在AFP阴性的病人中仍有较高的表达。Liu等[21]用针对GPC3的N端片段的抗体进行ELISA检测，结果发现原发性肝癌患者血清中AFP与GPC3蛋白的表达不具有相关性。由此可见，联合检测AFP和GPC3可提高原发性肝癌诊断的特异性和敏感性，GPC3对AFP阴性的原发性肝癌患者具有重要的诊断意义。

2.5 GPC3的表达水平与肝癌患者预后

Zhang等[14]研究显示，GPC3可作为治疗效果评价的指标，如病人血清GPC3水平在治疗后没有下降，提示治疗效果不佳。因此，在治疗过程中连续监测血清GPC3水平的变化有助于疗效的判断。Ning等[22]研究表明GPC3的表达与HCC手术后的转移和复发密切相关。HCC术后GPC3高表达患者的转移和复发风险是GPC3低表达患者的3.214倍。生存分析显示，GPC3高表达的HCC患者的总生存期明显短于GPC3低表达的HCC患者（P=0.003）。该研究表明，GPC3是预测HCC预后和术后转移复发的有效标志物。Shirakawa等[23]对107例接受手术治疗的患者进行5年随访，发现GPC3阳性组的5年生存率（54.4%）明显低于GPC3阴性组（87.7%）。16例首选手术治疗的GPC3阴性患者，在随访期间均没有死亡。多因素分析显示，GPC3的表达情况是肝癌独立的预后相关因素。

3 展望

由上可知，GPC3在肝细胞癌中特异性高表达，而在非肝细胞肝癌组织内不表达，其在肝细胞癌的诊断与鉴别诊断方面有重要的临床价值。动态观察外周血中GPC3表达水平有助于判断肝癌患者的预后、复发等情况,有望成为判断肝癌复发转移的一个有意义的预测指标。GPC3在肝癌患者尤其是小肝癌患者及AFP阴性的肝癌患者中有较高的敏感性和特异性,是目前发现的在AFP阴性肝癌中表达率较高的特异标志物。因此，GPC3在肝癌的早期诊断方面临床意义重大。联合检测GPC3和AFP可望显著提高肝癌的早期诊断率。由于GPC3是一个新颖的肿瘤标志物，其临床意义较大，目前GPC3的血清学检测没有统一的标准，尚无成熟的血清检测试剂产品可大规模应用于临床。因此，研发高端的GPC3免疫学检测试剂，以促进其尽快地应用到临床研究和疾病诊断中，已成为目前生物医药及临床检验等领域所思考和关注，并期望得以实施解决的问题。

[1] 汤钊猷. 从生物学角度看肝癌[J]. 医学研究杂志, 2008, 37(1): 1-3.

[2] Stefaniuk P, Cianciara J, Wiercinska-Drapalo A. Present and future possibilities for early diagnosis of hepatocellular carcinoma[J]. World J Gastroenterol, 2010, 16(4): 418-424.

[3] Shirakawa H, Suzuki H, Shimomura M, et al. Glypican-3 expression is correlated with poor prognosis in hepatocellular carcinoma[J]. Cancer Sci, 2009, 100(8): 1403-1407.

[4] Pilia G, Hughes-Benzie R M, MacKenzie A, et al. Mutations in GPC3, a glypican gene, cause the Simpson-Golabi-Behmel overgrowth syndrome[J]. Nat Genet, 1996, 12(3): 241-247.

[5] Huber R, Mazzarella R, Chen C N, et al. Glypican 3 and glypican 4 are juxtaposed in Xq26.1[J]. Gene, 1998, 225(1-2): 9-16.

[6] Oliver F, Christians J K, Liu X, et al. Regulatory variation at glypican-3 underlies a major growth QTL in mice[J]. PLoS Biol, 2005, 3(5): e135.

[7] Wang F H, Yip Y C, Zhang M, et al. Diagnostic utility of glypican-3 for hepatocellular carcinoma on liver needle biopsy[J]. J Clin Pathol, 2010, 63(7): 599-603.

[8] Capurro M, Wanless I R, Sherman M, et al. Glypican-3: a novel serum and histochemical marker for hepatocellular carcinoma[J]. Gastroenterology, 2003, 125: 89-97.

[9] Llovet J M, Chen Y, Wurmbach E, et al. A molecular signature to discriminate dysplastic nodules from early hepatocellular carcinoma in HCV cirrhosis[J]. Gastroenterology, 2006, 131(6): 1758-1767.

[10] Shafizadeh N, Ferrell L D, Kakar S. Utility and limitations of glypican-3 expression for the diagnosis of hepatocellular carcinoma at both ends of the differentiation spectrum[J]. Mod Pathol, 2008, 21(8): 1011-1018.

[11] Yao M, Yao D F, Bian Y Z, et al. Oncofetal antigen glypican-3 as a promising early diagnostic marker for hepatocellular carcinoma[J]. Hepatobiliary Pancreat Dis Int, 2011, 10(3): 289-294.

[12] 周伟, 郭霞, 曹志刚, 等. 血清Glypican-3检测在肝癌诊断中的临床意义[J]. 肿瘤, 2007, 27(9): 679-682.

[13] Hippo Y, Watanabe K, Watanabe A, et al. Identification of soluble NH2-terminal fragment of glypican-3 as a serological marker for early-stage hepatocellular carcinoma[J]. Cancer Res, 2004, 64(7): 2418-2423.

[14] Zhang Q Y, Xiao Q, Lin Z, et al. Development of a competitive radioimmunoassay for glypican-3 and the clinical application in diagnosis of hepatocellular carcinoma[J]. Clin Biochem, 2010, 43(12): 1003-1008.

[15] El-Shenawy S Z, Sabawi M M E, Sheble N, et al. Diagnostic role of serum glypican-3 as a tumor marker for hepatocellular carcinoma[J]. Nature and Science, 2012, 10(4): 32-38.

[16] Liu H, Li P, Zhai Y, et al. Diagnostic value of glypican-3 in serum and liver for primary hepatocellular carcinoma[J]. World J Gastroenterol, 2010, 16(35): 4410-4415.

[17] Tangkijvanich P, Chanmee T, Komtong S, et al. Diagnostic role of serum glypican-3 in differentiating hepatocellular carcinomafrom non-malignant chronic liver disease and other liver cancers[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2010, 25(1): 129-137.

[18] Ligato S, Mandich D, Cartun R W. Utility of glypican-3 in differentiating hepatocellular carcinoma from other primary and metastatic lesions in FNA of the liver: an immunocytochemical study[J]. Mod Pathol, 2008, 21(5): 626-631.

[19] Wang X Y, Degos F, Dubois S, et al. Glypican-3 expression in hepatocellular tumors: diagnostic value for preneoplastic lesions and hepatocellular carcinomas[J]. Hum Pathol, 2006, 37: 1435-1441.

[20] Lü Z L, Luo D Z, Wen J M. Expression and signi fi cance of tumor-related genes in HCC[J]. World J Gastroenterol, 2005, 11(25): 3850-3854.

[21] Liu F Y, Su N, Liang J Z, et al. The expression and signi fi cance of glypican-3 protein in the serum of patients with hepatocellular carcinoma[J]. Shandong Med, 2010, 50(1): 55-57.

[22] Ning S, Bin C, Na H, et al. Glypican-3, a novel prognostic marker of hepatocellular cancer, is related with postoperative metastasis and recurrence in hepatocellular cancer patients[J]. Mol Biol Rep, 2012, 39(1): 351-357.

[23] Shirakawa H, Suzuki H, Shimomura M, et al. Glypican-3 expression is correlated with poor prognosis in hepatocellular carcinoma[J]. Cancer Sci, 2009, 100(8): 1403-1407.

Advances in the relationship between the detection of glypican-3 in serum and the diagnosis of primary hepatic carcinoma

YU Juanping1, ZHANG Qiong1, XU Weiwen1★, LI Ming1,2
(1.Biological Technology Institute, Southern Medical University, Guangdong, Guangzhou 510515, China; 2.DA An Gene Co., Ltd. of Sun Yat-sen University, Guangdong, Guangzhou 510660, China.)

Glypican-3(GPC3) was con fi rmed to be a novel tumor marker for hepatocellular carcinoma(HCC) besides alpha-fetoprotein(AFP). With the constant deepening of GPC3 research, it was found not only in tissues of patients with HCC but also in the serum. In the diagnosis of HCC, there were higher sensitivity and speci fi city, especially in the early stage, which had great value in clinical application, and bring new hope for the diagnosis of HCC.

Glypican-3; Hepatocellular Carcinoma; Diagnosis

国家863项目（2012AA020205）；广东省产学研项目（2010B090400422）

1.南方医科大学生物技术学院，广东，广州 510515 2.中山大学达安基因股份有限公司，广东，广州 510660

★通讯作者：徐伟文，E-mail:xu_sandy2006@126.com