孙校男 郭勇

蛋白质组学在姑息期血瘀证大肠癌中的表达研究

孙校男 郭勇

目的 探讨姑息期血瘀证大肠癌血清差异表达的蛋白质及意义。 方法 选取姑息期血瘀证、气血亏虚证大肠癌患者各6例（血瘀证组、亏虚证组），另择同期健康平衡体质者6例（对照组），通过双向凝胶电泳以及质谱鉴定和生物信息学分析，寻找血瘀证组患者血清中特异表达的蛋白质。 结果 血瘀证组出现7种差异表达的蛋白质：在血瘀证及气血亏虚证中均升高的蛋白质为触珠蛋白、IL-8、转移相关蛋白、血管生长因子受体-1，均降低的为血清淀粉样蛋白A；在血瘀证中高表达而在气血亏虚证中低表达的是载脂蛋白A-I前体；而在血瘀证中低表达且在气血亏虚证中高表达的是纤维结合蛋白。 结论 7种差异表达蛋白质的组合性变化可能是姑息期血瘀证大肠癌的物质基础，具有潜在的诊断、评估预后或指导治疗的价值。

大肠癌 瘀血证 血清蛋白 蛋白质组学

大肠癌是最常见的消化道肿瘤之一，在欧美国家其发病率高居消化道恶性肿瘤的第一位[1]，在我国的发病率正逐年增高，已成为威胁生命的一个重要危险因素。目前，大肠癌治疗提倡在循证医学原则指导下多学科综合的个体化治疗，其中中医药治疗在改善患者生存质量、提高生存率、对放化疗增敏减毒、预防肿瘤复发和转移方面均显示出了较大的潜力[2]。中医治疗核心为辨证施治，对于相同疾病不同证型治疗采用“同病异治”的原则，而证型间差异的本质可能是功能蛋白质的差异。本研究旨在对姑息期血瘀证大肠癌中蛋白质组学的表达进行初步分析，以期发现特异性蛋白质表达，为临床治疗提供帮助。

1 材料和方法

1.1 血清标本 选取2009-01—2009-06浙江省中医院收治的晚期结肠癌患者12例，均经病理诊断确诊。血瘀证、气血亏虚证的诊断依据《现代中医临床诊断学》相关标准[3]，符合3项主要症状或2项主要症状并有2项次要症状。排除以其他合并疾病影响大肠癌证候辨证的患者，排除合并有严重的心、肺、脑、肝、肾等脏器疾病的患者，以及神志不清、无法语言交流的患者。其中血瘀证患者6例（血瘀证组），男5例，女1例，年龄45～67（65.83±3.97）岁；肿瘤TNM分期：ⅢB期1例，ⅢC期1例，ⅣA期4例。气血亏虚证患者6例（气血亏虚证组），男5例，女1例，年龄47～81（69.83±1.94）岁；肿瘤TNM分期：ⅢB期1例，ⅢC期1例，ⅣA期3例，ⅣB期1例。另择同期健康平衡体质患者6例（对照组），男3例，女3例，年龄55～75（66.16±8.52）岁。3组患者性别及年龄的差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

1.2 试剂和仪器 丙烯酰胺（Acrlamide）、尿素、Tris-HCL、CHAPS、二硫苏糖醇（DTT）、十二烷基磺酸钠（SDS）、Cyder染料（Cy2，Cy3，Cy5）、2-D clean up试剂盒、蛋白定量试剂盒、二甲基甲酰胺（DMF）、固相PH梯度胶条（IPG DryStrip，24cm，pH3～10 NL）均购自GE Healthcare公司，碳酸氢铵、氢氧化铵购自国药集团，胰蛋白酶购自sigma公司。EttanTM IPGphorTM等电聚焦电泳仪、EttanTM DALTSix垂直板电泳仪、Typhoon 9400多功能荧光扫描成像系统、DeCyder Image QuantTM V6. 5凝胶图像分析软件均为GE公司产品。P80MX超速冷冻离心机为日本日立公司产品，基质附助激光解吸飞行时间串联质谱仪4800（MALDI-TOF-TOF-MS）为美国应用生物系统公司产品。

1.3 方法

1.3.1 血清处理及蛋白质提取 晨间空腹采血，取外周静脉血3ml于非抗凝的灭菌离心管中，室温下静置2h，离心，吸取上清液，保存于-80℃生物冰箱中备用。将各组6份血清等量吸取后混合。经Proteo Extract Albumin/IgG Removal Kit亲和柱分别除去白蛋白和球蛋白，收集流出液，取上清液用2-D clean up kit去杂，并用2-D定量试剂盒测定蛋白质浓度后调至统一浓度1.25%，置-80℃保存。

1.3.2 蛋白质荧光标记 将CyDye（Cy2,Cy3,Cy5）加入25μl DMF，离心后取出2μl配成200pmol/μl的工作液，每个混合后样品各取50μg蛋白质（每组做2块重复胶），调节pH值至8.5，加入400pmol相应染料，振荡混匀，1μl赖氨酸中止反应，冰上避光放置10min，加入2倍体积缓冲液冰浴10min。

1.3.3 双向电泳 3组蛋白提取物分别用荧光染料Cy3、Cy5标记。3组蛋白提取物等量混合用Cy2标记作为内标。取等量Cy2、Cy3、Cy5标记的样品混合，用水化液定容至450μl，制成第一向等电聚焦体系。样品加至pH值3～10的非线性胶条中。等电聚焦的参数：30V 12h；200V 1h；500V 1h；1 000V 1h；8 000V 3h。等电聚集后，将胶条平衡2次（15min/次），IPG胶条转移进行第二向电泳，电泳参数设定为：30W 45min；100W 6h。至溴酚蓝染料迁移至胶的底部边缘，结束电泳。

1.3.4 图像扫描分析与质谱分析 荧光标记蛋白经凝胶电泳后在Typhoon9400荧光扫描仪上成像，所用的滤光片和PTM电压如下：Cy2：Blue2（488）/600；Cy3：Green（530）/680；Cy5：Red（633）/590。 用 DeCyderImage QuantTM V6.5图像分析软件进行点识别、背景消除、点匹配及差异蛋白质分析。然后将需要进行鉴定分析的差异蛋白质点切下、脱色、透明、酶解、萃取、脱盐和吸干，用于质谱分析。将样品放入质谱仪中进行MALDI-TOF-TOF-MS检测，得到肽质量指纹图谱，通过Mascot数据搜索鉴定蛋白质。当匹配分数达到或超过软件规定分值时，待测蛋白的氨基酸序列与数据库中某已知蛋白的氨基酸序列覆盖率较高，即认为匹配的可能性很大；反之，则认为匹配的可能性较小。

2 结果

双向电泳后用488、530、633nm的3种波长的激发光进行扫描胶块，获得不同组样品蛋白质组图谱（图1）。选择血瘀证组与气血亏虚证组、平衡体质组相比较表达差异超过15%的蛋白质作为差异蛋白质，其图谱分析见图2，其中MTA1、VEGFR-1、Haptoglobin的肽指纹图谱见图3。血瘀证组差异表达蛋白质点相关信息及质谱鉴定结果见表1，可见血瘀证组出现7种差异表达的蛋白质：在血瘀证及气血亏虚证中均升高的蛋白质为触珠蛋白、IL-8、转移相关蛋白（MTA1）、血管生长因子受体-1（VEGFR-1），均降低的为血清淀粉样蛋白A（SAA）；在血瘀证中高表达而在气血亏虚证中低表达的是载脂蛋白A-I前体；而在血瘀证中低表达且在气血亏虚证中高表达的是纤维结合蛋白。

3 讨论

中医关于血瘀证的论述，最早出现在《内经》中“恶血”、“凝血”等名。《圣济总录》中记载：“瘤之为义，流滞而不去也”，反映了恶性肿瘤与血瘀证之间有非常密切的关系。相关实验研究也证实了肿瘤浸润转移与血液流变学变化呈正相关[4]，且其血液的高凝状态随着随疾病进展有增高趋势[5]。本研究结果显示，血瘀证组及亏虚证组中均升高的为触珠蛋白、IL-8，均降低的为SAA；在血瘀证组中高表达而在亏虚证组中低表达的是MTA1、载脂蛋白A-I前体、VEGFR-1；而在血瘀证组中低表达且在亏虚证组中高表达的是纤维结合蛋白。

图1 蛋白质组图谱（a：平衡体质组，b：血瘀组，c：气血亏虚证组）

图2 血瘀组蛋白质组差异分析图

图3 蛋白质肽指纹图谱

表1 蛋白质点相关信息及质谱鉴定结果

MTA1是一个与肿瘤转移相关、具有组蛋白脱乙酰基活性的基因，通过改变组蛋白的乙酰化状态进而调控基因表达，在信号传导通路中发挥一定作用。目前，多项研究证实MTA1与多种恶性肿瘤的预后有关。Higashijima[6]等对74例术后大肠癌患者进行随访，发现免疫组化MTA1阳性组患者5年生存率为50.5%，MTA1阴性组患者5年生存率为73.1%。本研究中血瘀证组及气血亏虚证组患者均有MTA1的升高，而血瘀证患者的表达高于气血亏虚证患者，提示血瘀证患者更易出现肿瘤转移。

血管内皮生长因子属血小板源性生长因子家族的生长因子，刺激血管内皮细胞的有丝分裂和血管的发生。其特异性地与相应的VEGFR-1相结合使受体自身磷酸化而激活细胞内信号传导通路。目前，临床发现其与肿瘤的血管形成关系密切，并与抑制肿瘤细胞的凋亡、促进细胞增殖有关[7]。Li等[8]发现，在肝癌细胞中侵袭力强的细胞VEGFR-1较侵袭力低的细胞表达量高，肝癌组织中其表达也高于癌旁组织。本研究结果亦显示，血瘀证患者VEGFR-1的表达明显高于对照组及气血亏虚，提示预后不佳。

触珠蛋白是血清α2球蛋白组分中的一种酸性糖蛋白，由2条轻链（α链）和2条重链（β链）组成四聚体，其主要功能是与游离血红蛋白结合将其运至肝中代谢。触珠蛋白还能促进新生血管的内皮细胞分化和生长，是一种重要的血管生成因子。Sun[9]等采用免疫组化的方法进行研究，发现在结肠癌肝转移的患者中触珠蛋白较无转移者更高，考虑可能对于结肠癌肝转移有预示作用。Sarvari等[10]研究发现，触珠蛋白α-2链在肝癌中较肝硬化中表达更高。本研究结果显示，触珠蛋白在血瘀证组及气血亏虚证组中均升高，且在血瘀证中表达更显著，提示血瘀证肿瘤患者较气虚亏虚证患者预后更差。

纤维结合蛋白在抗感染、维持微血管的完整性等方面具有重要作用。纤维连接蛋白的合成减少和（或）降解增加，导致细胞表面结合力下降，使癌细胞脱离原发部位，在组织间迁徙，形成转移灶。本研究中血瘀证患者纤维连接蛋白下调提示易发生肿瘤转移。血瘀证中存在血液高凝状态，导致组织缺氧，酸中毒，而肿瘤是血管依赖性的，因而肿瘤血管生成的因子的大量分泌，促进肿瘤血管供血，提示预后不佳。本研究发现血瘀证患者MTA1、触珠蛋白、VEGFR-1与肿瘤血管生长及肿瘤转移有关的蛋白均高表达，而维持血管完整性的纤维蛋白合成减少提示预后不佳。另外，本研究还发现其中IL-8、SAA、载脂蛋白A-I前体与炎症反应有关。

有学者研究发现，IL-8与肝癌细胞的浸润性生长或转移有关[11]。肿瘤细胞的浸润性生长或转移可使内皮细胞遭到破坏，导致炎症反应强烈，刺激机体免疫活性细胞分泌大量IL-8等细胞因子。本研究中血瘀证组IL-8的表达明显高于其他两组。汪晓东等[12]发现，结直肠癌患者SAA水平升高，并发现随着肿瘤分期的提高其水平也增高。但在本研究中发现此蛋白均较对照组下降，具体原因及机制尚不明。血清载脂蛋白Al前体除了在脂质代谢中发挥核心作用，亦具有抗炎作用，抑制单核巨噬的活化和释放IL-1β、TNF-α等炎性因子。本研究中血瘀证组患者血清载脂蛋白Al前体高表达，提示机体抑制过剧烈的炎症反应。

综上所述，本研究发现的7种差异表达蛋白质涉及炎症反应及肿瘤血管生长及肿瘤转移等方面，这些蛋白质的组合性变化可能是大肠癌血瘀证的物质基础，具有潜在的诊断、评估预后或指导治疗的价值。但本研究发现的7种蛋白质是大肠癌共有还是血瘀证特有尚需进一步研究证实。

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Proteomics and TCM syndromes in palliative stage of colorectal cancer

SUN Xiaonan，GUO Yong.Affiliated Hangzhou Xixi Hospital

of Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310053,China

【 Abstract】Objective To investigate differentially expressed serum proteins in palliative stage colorectal cancer patients with blood stasis syndrome and blood/qi deficiency syndrome. Methods Two-dimensional difference gel electrophoresis and mass spectrometry were used to screen the differentially expressed serum proteins among 18 patients with blood stasis syndrome and blood and qi deficiency syndrome;6 healthy subjects with yin-yang harmony served as controls. Results Interleukin-8 and haptoglobin were highly expressed in patients with blood and qi deficiency syndrome and blood stasis syndrome; while serum amyloid A protein precursor(SAA)was decreased in both groups.Metastasis-associated protein,apolipoprotein A-I precursor,vascular endothelial growth factor receptor-1 were highly expressed in blood stasis syndrome group while decreased in patients with blood and qi deficiency syndrome.Fibronectin was decreased in patients with blood stasis syndrome,while highly expressed in patients with blood and qi deficiency syndrome. Conclusion The proteins identified in this study may be related to the development of blood stasis syndrome in patients with colorectal cancer and might be used as molecular targets for diagnosis and treatment of the syndrome.

Colorectal cancer Blood stasis syndrome Serum protein Proteomics

2012-07-13）

（本文编辑：欧阳卿）

浙江省中医药科技计划重大项目（2007ZA007），浙江省中医药科技计划一般项目（2011CA031）

310053 杭州，浙江中医药大学附属杭州市西溪医院（孙校男）；浙江中医药大学第一临床医学院（郭勇）