刘锴栋　袁长春　黎海利　陈春华　谭雪琼

摘 要： 【目的】为指导杨桃种质资源的引进以及良种选育提供科学依据，【方法】采用形态标记数量聚类分析和RAPD分子标记相结合，对广东地区10份杨桃品种资源进行遗传多样性分析，并将形态学聚类和RAPD分子标记聚类结果加以对比。【结果】在所观察的12个形态性状中，变异系数为14.08%～49.71%，平均变异系数为25.38%。从100条RAPD随机引物中筛选出10个引物，共扩增出58条带，其中53条为多态性带，多态率达93.02%。聚类分析结果表明，形态标记和RAPD标记都可依果实风味将供试材料分组，即甜味和酸味。2种标记方法的相关系数为r0.01=0.685 3，达到显著水平。【结论】杨桃具有丰富的遗传多样性，2种方法聚类结果相似，且相关性高，具有较高的可靠性。

关键词： 杨桃； 形态性状； RAPD； 聚类分析

中图分类号：S667.9 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2013？雪01-0069-06

杨桃（Averrhoa carambola L.）又名五敛子、阳桃、洋桃等，属酢浆草科（Oxalidaceae）杨桃属（Averrhoa Linn.）植物。因其横切面如五角星，故国外又称之为“星梨”[1]。最早从马来西亚及越南传入我国，已有2000多年栽培历史，是久负盛名的岭南佳果之一。杨桃果形美，味甜，具有较高的营养价值。既可鲜食，也可加工成多种加工品。叶、果、花、根都可入药。此外，杨桃生长快，早结丰产，可周年供果，耐旱、耐瘠，适应性强，病虫害少，经济效益好，是著名的岭南佳果之一[2-3]。

广东省作为杨桃的主要产区，近年来从台湾、新加坡、马来西亚、泰国等地引进许多新的品种，并通过嫁接方式培育了不少经济价值高的品种。随着引进品种的不断增多，而当地又有不少地方品种，这就造成杨桃品种繁杂和混乱，且出现了不少同名异种或同种异名现象，给果农选种育苗带来较大的困难，也对产量造成很大的影响。

目前对于杨桃种质资源遗传多样性的研究报道较少，刘韬等[4]对福建省主要杨桃品种遗传多样性进行了RAPD分子标记分析，将17份杨桃品种划分为3 个类群，并得出杨桃品种资源之间具有丰富的多态性，证明了RAPD标记在杨桃遗传多样性研究中的可行性。传统的遗传多样性和亲缘关系的研究方法除了分子标记还有根据形态特征来进行研究的方法。而分子标记与形态性状的聚类分析结果各有侧重，相互补充[5]。在研究中把分子生物学手段与形态性状比较鉴定结合起来分析可以避免单一方法对研究结果造成偏差[6-7]，而且结合形态标记和分子标记技术来研究植物种质资源遗传多样性和亲缘关系已被证实是可行和可靠的[8-9]，但应用这2种技术对杨桃进行遗传多样性研究至今未有报道。

因此，笔者利用RAPD技术和形态标记数量聚类分析方法对广东地区10个主要杨桃品种进行遗传多样性分析，并对其进行综合客观评价，以期为杨桃种质的鉴定、保存、创新以及嫁接栽培选择合适的砧木提供科学依据。同时，通过对广东杨桃品种的遗传多样性进行评估，为当地杨桃资源保护、种质资源的引进、新品种选育以及核心种质构建提供参考和科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料

材料分别采集于广东地区湛江、茂名、阳江等地种植的台湾、泰国、马来西亚和新加坡等7个引进品种和粤西地区3个本地品种的叶片，具体见表1。

1.2 植物学特征的统计与编码赋值

杨桃果树叶性状在果树达到生长盛期时调查，在种植地随机选取5株有代表性的植株，每株随机选取10枚叶片观察，数量性状的记录数值为5株的平均值；果实性状的调查在达到商品成熟度时进行；在种植地随机选取生长正常的杨桃5个，数量性状的记录数值为5个果实的平均值。通过对各杨桃品种叶片和果实的形态观察，分别选取12个性状进行数量分类研究，并进行编码赋值。调查的具体性状和编码情况见表2。参照郭先锋等[10]的数量分类学方法对不同品种进行聚类分析，并绘制树状图。

1.3 DNA提取方法及检测

杨桃总DNA的提取采用改良的2×CTAB法[11]，用紫外分光光度计在260 nm和280 nm下测定OD值，检测DNA的质量和浓度，并稀释到30 mg·L-1。

1.4 RAPD标记

从100条随机引物中筛选出10条条带清晰、稳定、重复性好、多态性强的引物，并用这10条引物对10份杨桃样品的总DNA进行扩增。

RAPD-PCR反应体系为25 μL，其中包括： 10×PCR buffer 2.5 μL，20 mmol·L-1 MgCl2 2.5 μL，2 mol·L-1 dNTP 2.5 μL，8 pmol·L-1随机引物1 μL，2 U Taq酶，30 ng模板DNA。扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，37 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，共45个循环；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。扩增反应在PCR仪上进行。反应结束后，扩增产物在1×TAE缓冲液中，用1.5%琼脂糖凝胶（含GoldView I 型核酸染色剂）中以5 V·cm-1的电压电泳分离。用BioRad凝胶成像系统进行拍照分析。

1.5 数据统计与计算

1.5.1 形态数据统计与计算 形态数据的变异系数计算为性状标准差/性状平均值；聚类分析使用“DPS数据处理系统”中的“多元分析—聚类分析”软件包完成，数据标准化使用“标准差标准化”命令，相似性系数的计算使用“欧式距离系数”，聚类方法采用非加权组平均法（UPGMA）[12]。

1.5.2 RAPD 数据统计与计算 将电泳图谱清晰且可重复的条带赋值为1，同一位置上的弱带且不重复或未出现带的赋值为0，形成1、0数据矩阵，计算单位引物扩增的条带、多态性条带及多态性条带百分率[13]。根据Nei-Li相似系数法[14]，采用DPS数据处理系统计算出遗传距离。以遗传距离为标准，用非加权组平均法（UPGMA）进行聚类分析，生成聚类图。

1.5.3 形态数据与RAPD数据的比较 利用“DPS数据处理系统”，得到由形态学指标计算生成的欧氏距离矩阵和由电泳条带赋值计算生成的RAPD遗传距离矩阵。然后用Mantel test[15]对由形态学指标计算所得的欧氏距离矩阵和RAPD遗传距离矩阵之间的相关性进行检测。具体使用TFPGA软件中的Mantel test模块检测。2个矩阵输入TFPGA软件包[16]，利用其中的Mantel test模块检测2者相关性，显著性检验共进行10 000次随机运算[15]。

2 结果与分析

2.1 杨桃供试材料的植物学形态数量性状分析

对10个杨桃品种的7个植物学形态数量性状的基本数据统计分析结果表明，7个数量性状的平均变异系数为25.38%，其中以单果质量性状变化最大，变异系数为49.71%。单果质量最大的是‘秤锤，平均单果质量为402.43 g；单果质量最小的是细花，平均单果质量为81.73 g。叶长宽比性状差异也较大，最大的是‘细花，为3.12，最小的是‘台农一号，为1.5。因此，可以从果实质量和叶片长宽比来区分各种质。变异系数最小的是叶面积，为14.08%，也超过了10%。以上结果说明各性状在不同种质材料之间存在着较大差异以及不同程度的多样性。

2.2 杨桃供试材料植物学形态性状聚类分析

对10个杨桃品种的12个植物学形态性状（包括质量性状和数量性状）的基本数据进行统计和聚类分析，结果如图1。当λ=5.31时，10个杨桃品种分为两大类，本地酸杨桃品种‘细花、‘新桥和‘麻章二号聚为一类，其余外来引进品种聚为一类。当λ=3.18时，可将供试品种分为5类，‘台湾红杨桃和‘秤锤2个品种聚为一类，这2个品种均来自台湾，都表现出单果质量量大、汁多味甜、叶卵形和叶长较短等特点；‘泰国杨桃和‘马来西亚B17归为一类，2个品种均表现出叶长和叶宽较大、果实较长和单果质量量较大等特点；‘蜜丝、‘台农1号和‘新加坡杨桃为一类；‘细花单独为一类；‘新桥和‘麻章二号聚为一类。‘新桥和‘麻章二号这2个粤西本地品种均表现出果实味道较酸、叶较长、单果质量量较小等特点。由以上结果可以看出，基于杨桃形态性状的聚类结果能较好地反映种质间的亲缘关系和形态相似性。

2.3 RAPD引物筛选及多态性分析

通过对10份杨桃种质资源的总DNA进行PCR扩增，10条随机引物共扩增出58条可区分的、重复性高的DNA条带。统计结果显示，共有检出位点58个，不同的随机引物扩增结果各不相同，其中单态位点5个，多态位点53个，多态率达93.02%。G9引物的扩增位点最多，为9个扩增位点。平均每个引物扩增出条带5.8条。这说明RAPD扩增出来的杨桃DNA片段多态性比较丰富，同时也表明这10份杨桃样品在分子水平上存在明显的差异。

2.4 杨桃供试材料RAPD分子标记聚类分析

基于遗传距离进行聚类分析所得的树状图见图2。10份杨桃遗传距离为0.16129～0.53146。当λ=0.48时，10份杨桃可以划分为3个类群：第I类群包括‘台湾红杨桃、‘秤锤、‘马来西亚B17、‘台农1号、‘蜜丝、‘新加坡杨桃、‘泰国杨桃；第II类群包含‘新桥和‘麻章二号2个本地品种；第III类群包括‘细花。根据杨桃风味可以划分为甜杨桃和酸杨桃两大类，聚类分析结果表明，第I类群的杨桃品种基本都属于甜杨桃品种，且都是外来引进品种，来自台湾的‘台湾红杨桃、‘秤锤、‘台农1号和‘蜜丝这4个品种聚为一起，遗传距离较近；第II、III类群中的杨桃品种都是广东粤西地区的酸杨桃品种。

2.5 杨桃供试材料RAPD标记与形态学之间的相关分析

利用TFPGA软件中的Mantel test模块检测对由基于形态标记计算的遗传距离矩阵和由RAPD标记计算的遗传距离矩阵作相关分析，分析2个距离矩阵数值（图3），得出两个矩阵的相关系数为r0.01=0.685 3，达到显著水平，表明RAPD分子标记与形态标记所反映的品种间的遗传多样性有较高的一致性和可信度。因此将两标记结合起来可以较好地揭示杨桃种质的遗传多样性。

3 讨 论

3.1 广东地区主要杨桃品种具有丰富的遗传多样性

近年来，广东省大力发展杨桃生产，从台湾、泰国、马来西亚和新加坡等地引进了不少优良品种，使得广东杨桃种质资源类型不断丰富。但是由于频繁引种，也使得广东地区杨桃种质资源较为混乱，因此分析它们之间的遗传差异有助于指导种质资源的引进和品种遗传改良，提高品质和产量。

植物性状遗传多样性的数量化表现主要集中在性状的变异频率，其中变异系数越大，就说明样本间的差异越大，可以在优异种质资源中有更大的选择余地[17-18]。一般认为变异系数大于10%就说明样本间的差异较大。本文对10个杨桃品种的形态性状分析结果表明，各性状之间的变异系数为14.08%～49.71%，平均变异系数为25.23%，叶长7.03～10.71 cm，叶宽3.12～5.34 cm，叶面积23.69～38.23 cm2，叶长宽比1.34～3.12，果长7.50～12.20 cm，单果质量81.73～402.43 g，整株果质量45.23～129.76 kg。各个性状的变异系数均高于10%，说明各材料之间存在较大差异。RAPD扩增条带中，多态性达到93.02%，可见杨桃种质资源在分子水平上存在遗传差异。综合分析，杨桃资源具有较为丰富的遗传多样性和遗传背景的复杂性，存在较大的遗传变异和选择潜力，这与刘韬等[4]的研究结果较为一致。

从杨桃的RAPD分析结果可知，‘马来西亚B17、‘台农1号、‘秤锤都聚为一类，特别是‘马来西亚B17和‘台农1号紧密聚在一起，这与刘韬等[4]的研究结果完全一致。但是有所不同的是，本研究中的‘泰国杨桃是和‘马来西亚B17、‘台农1号、‘秤锤等都聚为一类的，而刘韬等[4]的研究结果显示泰国种在聚类分析处于不同的类群，这可能是因为两个研究中‘泰国杨桃可能存在同名不同种的现象，有待进一步分析探讨。本研究RAPD聚类分析中第I类群的杨桃品种基本都属于甜杨桃品种，且都是外来引进品种，刘韬等[4]的RAPD聚类分析研究结果也显示第I类群的杨桃品种全为外来引进品种。这说明，由分子标记RAPD技术分析反映得出的亲缘关系远近和遗传多样性的情况可以得到重复性、可靠性的试验结果。RAPD技术只要材料选择合适、反应条件控制严格、分析数据详实合理，就完全可以应用在杨桃品种亲缘关系分析过程中。

3.2 形态标记和RAPD分子标记结合分析具有一定的可靠性

在植物学性状的比较分析中，形态学方法是最古老的物种鉴定方法，它具有直观、标记简便、容易获得等特点，目前仍是植物遗传多样性研究的主要方法[19]。本研究基于形态标记的聚类分析结果将广东地区杨桃主要品种划分为两大类，各类之间的形态差异较明显。但由于表型是环境和基因型互作的结果，受环境影响较大，有些表型的变化并不是可遗传的变异，因此单从形态学上研究遗传多样性具有一定的局限性[20]。部分研究结果也表明，形态性状的差异不一定能反映遗传上的差异，形态性状的相似也不一定意味着遗传关系的近缘[21]。近年来， 一些分子标记方法逐步引入了植物的遗传多样性分析，刘韬等[4]对福建省主要杨桃品种遗传多样性进行了RAPD分子标记分析，将17份杨桃品种划分为3个类群，多态率达97.19%，证实了RAPD 技术可以准确侦测到种间的遗传多态性。因此，有必要结合形态学和RAPD标记技术对杨桃品种遗传多样性进行更系统、更全面的分析。

本研究认为，无论是形态学标记还是RAPD分子标记的结果都可以把杨桃分为甜杨桃和酸杨桃，这与传统的分类方法基本相符。这说明利用2种标记对杨桃种质进行区分和鉴定都是行之有效的。利用Mantel test[15]对由形态学指标计算所得的欧氏距离矩阵和RAPD遗传距离矩阵之间的相关性进行检测，得出由2种技术得出矩阵的相关系数为0.685 3（P<0.01），达到显著水平，这说明形态标记和RAPD标记匹配良好。且实验结果表明形态标记对杨桃种质分类有一定的可信度，RAPD分子标记可将种质间的遗传差异进一步表现出来。同时2种方法都基本可将杨桃品种按照种质来源明显的区分开来。3个来自广东粤西地区的本地品种都聚为一类，来自台湾地区的‘台湾红杨桃、‘秤锤、‘台农1号和‘蜜丝4个品种在RAPD标记聚类分析中能聚在一起。因此，在杨桃遗传多样性研究和育种实践中，可以以分子标记为基础，与形态性状充分结合，展开分析，提高选种、育种工作的实际效率。

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