曹尚银 沈程清 曹达 薛华柏 谢深喜 李好先

摘 要： 【目的】为了探明盐胁迫下枣蛋白表达的差异，【方法】以较耐盐碱的‘七月鲜枣品种的扦插苗为材料，经过临界浓度（0.60%）的钠盐（NaCl）处理，取其叶片进行蛋白质双向电泳，经ImageMaster 2D分析，【结果】结果表明，处理与对照之间总蛋白的整体分布模式非常相似，在pH 3～10和MW50～90 kD内的蛋白点分布最多，处理与对照之间量变倍数大于1.5倍的差异点有26个，其中6个蛋白受胁迫上调， 20个蛋白受胁迫下调。在上调的蛋白质点中，3个点受盐胁迫诱导增加了近4倍，2个蛋白质点相对丰度增加了2倍以上，表现出强烈的盐诱导特性。说明他们可能在枣的抗盐机制中发挥重要作用。在下调的蛋白质点中，2个点相对丰度降低至对照的5倍左右，表现出强烈的盐抑制特性，说明其可能是对盐胁迫比较敏感的2个蛋白质或多肽，并且在枣的抗盐性机制中也发挥比较重要的作用。【结论】在临界浓度钠盐胁迫下，枣叶片蛋白质表达有显著差异。

关键词： 枣； 盐胁迫； 蛋白质； 双向凝胶电泳

中图分类号：S665.1 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2013？雪01-0043-05

土壤盐渍化已经成为制约世界农业发展的重要因素，盐胁迫是影响植物生长、降低作物产量的重要因素。随着温室效应引起的全球气候变暖，使得部分地区环境持续恶化，预计到2050年全球将有超过50%的耕地会变得盐碱化[1-2]。探索植物耐盐机制，提高植物耐盐性，开展耐盐作物分子育种已成为一种有效的应对措施[3]，这对减轻人类所面临的土地资源和淡水资源短缺、粮食供需矛盾以及有效控制环境恶化都有着重要的战略意义。

枣原产我国，已有7700余年的栽培历史，较抗盐碱、耐旱、耐瘠薄。枣果实营养丰富，含糖量居各类果品之首，维生素C的含量高于柑橘10倍，高于苹果80倍，是梨的100倍。枣是我国优势果品，国外有30多个国家先后引种了我国的枣，但除韩国外均尚未形成规模化商品栽培，迄今98%的枣资源和100%的枣产品国际贸易集中在我国。目前我国的主要枣区大多是在过去不适宜耕作的山、沙、碱地区建立发展起来的。在河北、山东环渤金丝小枣产区和河南内黄扁核酸枣区历史上是著名的盐碱区，形成上千公顷的枣林带或林区，但产量较低，品质较差。近年来，我国的新疆和沿海地区，在盐碱地正探索大面积发展枣树生产。如何提高枣树的耐盐性已成为我们亟待研究的重大问题[4]。这不仅关系到提供枣产量和品质，更关系到国内外枣产品的供应，我国民族果树的振兴，关系到数百万枣农的小康生活，关系到盐碱地的综合治理与开发。

当前，关于枣树耐盐性的研究主要集中于生态学和生理生化特性研究[4]，而其耐盐性相关分子生物学研究，尤其是蛋白组学研究几乎无人涉及。研究尝试并确定了抗盐性较强的‘七月鲜枣叶片双向电泳体系，通过高通量的蛋白组学方法[5-6] ，分析枣耐盐胁迫反应相关蛋白，为进一步研究盐胁迫下枣叶片特异蛋白质的功能及揭示枣耐盐分子机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

试验在中国农业科学院郑州果树研究所枣良种圃进行，试验材料为‘七月鲜枣当年生扦插苗。扦插苗属于同一母树上发育良好、无病虫害及机械损伤的半木质化枝条快繁而成。盆栽基质为良种圃中普通土加草炭100 g·kg-1（干质量，下同）和河沙50 g·kg-1，混匀、过筛。盆土基质含有机质0.98%、速效氮（N）0.0067%，速效磷（P）0.0033%，速效钾（K）0.0115%，pH 7.12，含盐量0.026%。栽植用塑料（PVC）盆，高33 cm，上口径40 cm，下口径33 cm，底部有排水孔，置于托盘上。每盆装基质7.12 kg（干质量）。2009年3月12日每盆栽大小基本一致的3株枣苗， 每个处理3次重复，每个重复10盆，NaCl处理浓度为： 0， 0.60%（依文献[4]试验结果设计的超临界浓度（0.60%）的钠盐，按基质干质量计），取相应量NaCl加水至1 500 mL，一次浇入，自然光照避雨状态下培养，每5 d根据土壤湿度补充等量自来水，有溶液渗出到托盘中，于2 h后返浇盆中。第25天分别采集每株苗木中部3枚成熟叶片用ddH2O冲洗干净后迅速用滤纸轻轻擦干，称质量。

1.2 蛋白质的提取与定量

枣总蛋白的提取方法参照本实验室朱志勇等[7] 已经建立的苹果蛋白质提取的方法，略有改动。切取枣叶组织，切碎成3 mm×3 mm的小块，在液氮中，用研钵磨碎成细粉状。将组织细粉转入50 mL离心管中，加入25 mL TCA/丙酮（1∶9），65 mmol·L-1 DTT，-20 ℃沉淀1 h。离心10 000 r·min-1，45 min，去除上清，沉淀加入25 mL纯丙酮，-20 ℃沉淀1 h，离心10 000 r·min-1，45 min，去除上清，空气干燥，-80 ℃保存。

称取500 mg枣叶组织，加入0.5 mL全细胞裂解液（7 mol·L-1尿素，2 mol·L-1硫脲，65 mmol·L-1 Tris ，4% CHAPS，0.2%IPGbuffer），混均，超声破碎细胞（冰浴）。离心12 000 g，45 min，取上清，上清用0.22 μm过滤，获得澄清溶液。上清采用Bradford法定量，100 μg分装样品，-80 ℃保存。

1.3 枣叶部蛋白质双向电泳及凝胶检测

双向电泳根据Bio-Rad公司的ProteomeWorksTMSystem中的方法进行。样品制备后，用水化上样缓冲液将样品浓度稀释为1 g·L-1，用于双向电泳上样。第1向等电聚焦采用pH 3～10，17 cm非线性的IPG预制胶条，对处理样品分别取约含150 μg总蛋白的300 μL水化液，以主动水化上样的方式上样。等电聚焦程序设置为50 V， 14 h；250 V， 1 h；500 V， 1 h；1 000 V， 1 h；1 000～10 000 V线性上升5 h，10 000 V， 65 kVh；等电聚焦温度为20 ℃。聚焦完毕后采用两步平衡法，每步15 min。第2向电泳采用12% SDS-PAGE，在17℃循环水浴冷却下进行。双向电泳凝胶染色采用改良的银染法[5]。

1.4 双向电泳凝胶图谱分析

双向电泳凝胶图象扫描采用GS800光密度扫描仪（Bio-Rad），用PDQuest8.0版软件进行图像分析，斑点检测和匹配分析，找出差异蛋白。

1.5 作蛋白质强度柱状图方法

以不同胶为x 轴，不同胶中某一个差异点的定量值信息为Y轴；以灰色竖线分割两个组；蓝色横线表示该组内蛋白的集中趋势；红色横线表示该组内蛋白的离散度； a、 b、c分别代表对照的统计学dispersion 极值；而a、b、 c矩形条代表对照蛋白点统计学定量在该范围内变化（即离散区间）。d、e、f 分别代表处理的统计学dispersion极值；而d、e、f矩形条代表处理蛋白点统计学定量在该范围内变化（即离散区间）。作蛋白质强度柱状图。

2 结果与分析

2.1 枣叶片可溶性蛋白质提取率

配置考马斯亮蓝G-250蛋白质显色液，以标准蛋白质BSA作蛋白质浓度与OD值之间标准曲线。为了增加标准曲线的可靠性，不同浓度BSA标准品的光吸收值均设3次重复，pH调节到7.4（图1）。

抽提蛋白中，蛋白质提取率的高低是检验提取方法优劣的主要指标之一。本研究采用Bradford法对蛋白进行定量，用牛血清白蛋白（BSA）制作标准曲线，蛋白浓度在0～100 g·L-1内，R2=0.997 7。采用TCA丙酮沉淀法提取蛋白质，在λ=595 nm时，检测出枣叶片中蛋白平均浓度为11 g·L-1，其浓度较高，表明此蛋白提取方法较可靠，且为后续双向电泳图谱的清晰度、重复性奠定了基础。此外，提高样品中的蛋白浓度从而增加重泡涨液（水化缓冲液）的用量，能够使样品得到充分泡涨，第1向电泳的聚焦效果好，电压能上升到8 000 V，但样品蛋白浓度也不能过高，以不析出结晶为宜，否则亦会影响等电聚焦效果。

利用双向电泳技术对‘七月鲜枣叶片的蛋白进行分离，为保证试验的重复性，在相同条件下对2组样品分别进行了3次重复性试验（a、b、c为对照、d、e、f为0.6%NaCl处理过的‘七月鲜枣）。蛋白质浓度均为11 g·L-1，其总蛋白的整体分布模式非常相似： 在pH 3～10和MW50～90 kD内的蛋白点分布最多。其中检测到a蛋白质点为： 2 642个；b蛋白质点为： 2 386个；c蛋白质点为： 2 835个；d蛋白质点为： 2 333个；e蛋白质点为： 2 210个；f蛋白质点为： 2 576个。银染后获得的原始二维凝胶图谱结果如图2。

2.2 氯化钠胁迫下枣叶片蛋白质双向电泳分析

经扫描仪采集图像后，用Image Master 2D图像处理软件进行了背景消除、污染点去除和放大检测，共检测出枣在盐胁迫下26个蛋白质点发生了变化，其中6个上调蛋白、20个下调蛋白（图3）。

用蛋白质强度柱状图信息显示两组样品之间量变倍数大于1.5 倍差异点，26个受盐胁迫影响而变化明显的蛋白质点中，6个受胁迫上调，上调蛋白分别是1 717、1 253、1 459、1 233、2 120、2 474；20个受胁迫下调，下调蛋白分别是2 443、2 496、2 498、287、2 543、2 288、2 550、1 896、1 418、1 527、1 526、1 374、1 362、1 438、 6 811、655、1 528、1 182、647、492。在上调的蛋白质点中（图4），1 459、2 474、1 233变化最大，与对照相比，受盐胁迫诱导增加了4倍以上；其次是1 253和2 120 ，这2个蛋白质点在盐胁迫后相对丰度增加了2倍以上，表现出强烈的盐诱导特性，说明他们可能在枣的抗盐机制中发挥重要作用。在下调的蛋白质点中，2 543、2 498受盐胁迫抑制（图4）最大，其相对丰度降低至不到对照的五分之一，表现出强烈的盐抑制特性，说明2 543、2 498可能是对盐胁迫比较敏感的2个蛋白质或多肽，并且在枣的抗盐性机制中也发挥比较重要的作用；其他受盐胁迫抑制而相对丰度降低比较大（3倍以上）的蛋白质点还有647、1 527、287、492（图版）。

3 讨 论

差异蛋白质组学研究是目前蛋白质组学研究的热点之一。通过寻找某种特定因素所引起的细胞或组织的蛋白质组变化，并对某些标志性蛋白进行定性和功能分析，揭示这些差异蛋白与特定生理、病理过程的相关性，从而探察细胞或机体对环境刺激的反应及细胞调控的机制。通过获取的蛋白质样品的表达谱信息来进行差异蛋白质组研究为细胞信号调节、代谢途径、增殖分化等基础性生命科学研究提供了一个有效工具。生命科学研究已经从基因组时代走入到了蛋白质组时代，虽然，植物蛋白质组学研究要明显落后于医学相关的蛋白质组学研究的进程，但是，随着植物基因组和表达序列标签（EST）数据库的不断发展，借助人类和动物模型研究获得的方法，植物蛋白质组学也越来越受到关注，并取得了一定的研究成果。红海榄 （Rhizophora stylosa ）是一种典型的红树林盐生植物。 范吉星等[8]研究利用差异蛋白组学技术对淡栽（R0）和 30 g·kg-1氯化钠盐栽（R3）处理后的红海榄根部总蛋白进行了比较研究。 结果表明，在盐水栽培上调的蛋白质一般与逆境胁迫有关， 淡水栽培上调的蛋白质一般与基本代谢有关。 这些研究结果为进一步研究红海榄的耐盐机制提供了有意义的线索。在高盐胁迫下葡萄芽尖中 191 种蛋白质表达丰度发生变化， 其中约 44%为具有同工型的蛋白质， 且参与光合作用、 蛋白质合成和定位的蛋白质的表达丰度明显下调[9]。1997年，Ramani等[10]。以水稻幼苗叶片为材料，利用体内标记结合双向电泳和放射性同位素自显影技术，共检测到52个蛋白质与盐胁迫有应答关系。其中35个被盐胁迫诱导，17个被盐胁迫抑制，包括20个在这之前未曾报道的低丰度蛋白。这些发现对寻找盐压应答新基因，尤其是那些在水稻盐耐性获得中起瞬时调节作用的基因十分重要。在本实验中，以0.60%的钠盐（NaCl）处理‘七月鲜枣，结果表明，处理与对照之间蛋白质量变倍数大于1.5倍的差异点有26个，其中6个蛋白受胁迫上调， 20个蛋白受胁迫下调。在上调的蛋白质点中，3个点受盐胁迫诱导增加了近4倍，2个蛋白质点相对丰度增加了2倍以上，表现出强烈的盐诱导特性，说明他们可能在枣的抗盐机制中发挥重要作用。在下调的蛋白质点中，2个点相对丰度降低至对照的5倍左右，表现出强烈的盐抑制特性，说明其可能在枣的抗盐性机制中发挥了比较重要的作用。关于钠盐胁迫后枣叶片中发生显著变化的26个蛋白质点的具体生物学功能还有待于质谱鉴定以及进一步的、系统的功能解析研究。（本文图版见封3）

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