王国富，薛士鹏，白丽，吴利先

（大理学院基础医学院，云南大理671000）

王国富，薛士鹏，白丽，吴利先

（大理学院基础医学院，云南大理671000）

目的：构建福氏志贺菌重组双歧杆菌Bb-ipaB疫苗。方法：以福氏志贺菌DNA为模板扩增福氏志贺菌ipaB基因，双酶切后克隆到pGEX-1λT质粒上，构建重组质粒pGEX-ipaB，电穿孔法将该质粒转化入Bb，构建福氏志贺菌重组Bb-ipaB疫苗。结果：成功扩增出分子量约为1 711 bp的ipaB基因，双酶切证实基因成功插入pGEX-1λT中，并成功转化入双歧杆菌，构建rBb-ipaB疫苗。结论：成功构建福氏志贺菌重组rBb-ipaB疫苗，为该疫苗的进一步研究奠定了基础。

福氏志贺菌；双歧杆菌；重组Bb-ipaB疫苗；构建

细菌性痢疾（bacillary dysentery）是由志贺氏菌感染引起的常见肠道急性传染病，以细菌侵入肠上皮细胞引起结肠化脓性炎症为主要病变。因此细菌的侵入是其致病的关键〔1〕。志贺菌胞内含有一个大小为230 kb的毒性质粒是其主要致病因子，毒性质粒上有31 kb大小的基因片段编码的侵袭质粒抗原（invasion plasmid antigen，Ipa）是志贺菌致病所必需的〔2〕。Ipa抗原包括四种，分别为A、B、C和D。研究认为其中抗原B（IpaB）和C（IpaC）以复合物形式存在，介导了志贺菌入侵肠上皮细胞而引起炎症致病〔3〕。

两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidium，Bb）是一种常见的肠道益生菌。可作为基因工程受体菌能发挥原有的益生功能外，还能发挥外源重组特殊基因的功能。因此构建重组Bb-ipaB福氏志贺菌疫苗，有重要的临床意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料福氏志贺菌2a 2457T（Nalr）由王恒梁博士惠赠，两歧双歧杆菌购自武汉大学菌种保存中心，大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT由李文桂教授惠赠。限制性内切酶、纯化试剂盒和DNA连接试剂盒购自大连宝生物工程公司。电转化仪和电转化杯为Eppendorf产品。PCR仪为PE公司产品。

1.2 目的基因的扩增从gene bank中找到ipaB基因序列，用Primer 5.0软件设计引物，上游引物为5'-CC GGATCC ATG AAA GCA AAT AAT C-3'；下游引物为：5'-CC GAATTC TTA TCG GTT TCT-3'由上海生工生物工程公司合成。上游引物引入BamHI的酶切位点，下游引物引入EcoRI的酶切位点。以福氏志贺菌2a 2457T（Nalr）DNA为模板PCR扩增ipaB基因，用1%的琼脂糖凝胶进行电泳观察并拍照。

1.3 穿梭重组质粒pGEX-ipaB的构建和鉴定大肠杆菌-双歧杆菌穿梭质粒pGEX-1λT和福氏志贺菌目的基因ipaB的PCR产物，分别用内切酶EcoRI和BHamI进行双酶切并纯化，然后将两种纯化产物按试剂盒的比例混合，用T4连接试剂盒在16℃的条件下连接过夜。连接过夜后产物用氯化钙法转化入感受态细胞BL21。用含氨苄青霉素的培养基LA筛选。挑取在LA上生长的阳性菌克隆液体培养过夜，提取质粒并用限制性酶切和PCR进行鉴定。最后上海生工生物工程公司进行序列测定。

1.4 双歧杆菌介导的志贺菌Bb-ipaB疫苗的构建和鉴定按参考文献〔4〕制备Bb的电转化用感受态细菌。取20 μL鉴定好的重组质粒pGEX-ipaB与50 μL制备后的Bb感受态细菌混匀，冰浴1 min后转移至专用的一次性的Eppendorf电穿孔杯中按参数进行电击转化。电击转化完毕后立刻无菌加入1 mL含0.5 mol/L蔗糖的双歧杆菌液体培养基，然后将所有液体轻轻移入试管中，在37℃厌氧条件下轻轻震摇培养2 h。最后将液体涂布于含氨苄青霉素的双歧杆菌固体琼脂平板上，待菌液吸收后置37℃倒置厌氧培养24～72 h。挑取筛选培养基上生长的阳性菌落，液体培养后提取质粒，PCR扩增ipaB基因及对重组质粒限制性酶切分析鉴定。

2 结果

2.1 ipaB基因的扩增的结果通过PCR扩增在1 711 bp左右出现了条带，见图1。

图1 ipaB基因的PCR扩增产物

2.2 重组质粒pGEX-ipaB的鉴定和序列测定以筛选到的阳性克隆的质粒为模板进行PCR鉴定和双酶切鉴定，所得到的结果均与预计相符，见图2。

图2 重组质粒pGEX-ipaB的鉴定

通过上述两种方法鉴定正确的克隆，提取质粒进行序列测定，结果与基因文库中的序列相符。从而说明福氏志贺菌重组质粒pGEX-ipaB已构建成功。

2.3 福氏志贺菌重组Bb-ipaB疫苗的鉴定将鉴定正确的上述重组质粒电穿孔转化Bb后，从rBb中提取质粒同样进行PCR和双酶切鉴定，也得到了与大小相符的片段，说明重组Bb-ipaB疫苗成功构建。

3 讨论

目前的研究认为，Ⅲ型分类系统（TypeⅢsecretion system，T3SS）是包括福氏痢疾杆菌在内的诸多G-菌进行细胞侵袭并将毒性蛋白注入宿主细胞继而引起炎症的关键所在。T3SS的核心是由每种细菌细胞膜上的基粒和突出于细胞膜的针尖管状结构组成〔5-6〕。此外志贺菌的致病性还与细菌上存在的毒力质粒有关。特别是毒力质粒上一个31 kb大小的基因片段编码着多种与侵袭相关的蛋白，包括侵袭性质粒蛋白（Invasion plasmid antigen，Ipa）A，B，C，D是志贺菌侵入肠上皮细胞所必需的〔7-8〕有研究显示在菌体外，IpaB与IpaC形成可溶性复合物IpaB-IpaC。此复合物可与位于上皮细胞基底面整合素α5β1结合，从而诱发了靶细胞内蛋白激酶活性改变，导致发生信号级联放大作用，介导了志贺菌的入侵而诱发炎症反应。有研究显示IpaB蛋白还参与了T3SS侵袭细胞的调控，从而介导了疾病的发生〔9-10〕，因此有必要对其进行深入研究。

双歧杆菌是法国学者Tissier从母乳营养儿的粪便中分离出的一种末端分叉的厌氧革兰氏阳性杆菌，是人体肠道内的一种益生菌。其本身可治疗慢性腹泻。有研究显示通过用双歧杆菌对慢性腹泻患者临床观察研究表明，在服药两周以后，患者大便次数正常，大便形状异常等临床症状消失，总有效率为90.3%，复发率低。用双歧杆菌作为制备福氏志贺菌疫苗的活载体具有许多优点：首先，所表达的靶基因ipaB不需要进行体外纯化，可直接用于免疫接种，这样就免去了蛋白质后处理的复杂工序；其次，单次接种即可诱导机体产生针对靶抗原的免疫反应，而且具有粘膜佐剂的作用，这样就免除了添加佐剂带来的副作用；另外，运用分子生物学手段，通过对不同靶抗原的剪切和拼接，还可使新型疫苗理想化。更重要的是这种载体价格低廉，适于大量生产，更容易被接受和认可。因此本研究构建福氏志贺菌Bb-ipaB疫苗，用于福氏志贺菌及其相关疾病的预防具有广阔的应用前景。

〔1〕Menard R，Dehio C，Sansonetti P J.Bacterial entery into epithelial cells：the paradigm of Shigellosis〔J〕.Trends Microbiol，1996，4（6）：220-226.

〔2〕Sasakawa C，Kamata K，Sakai T，et a1．Virulence-assosiated geneticregionscomprising31kilobases ofthe230．kilobaseplamaid in Shigella flexneri 2a〔J〕．J Bacteriol，1998，170：2480-2484．

〔3〕Menard R，Dehio C，Sansonetti P J.Bacterial entery into epithelial cells；the paradigm of Shigellosis〔J〕.Trends Microbiol，1996，4：220-226.

〔4〕王国富，高峰，吴利先.幽门螺杆菌重组Bb-hpaA-vacA疫苗的构建〔J〕.中国人兽共患病学报，2012，28（2）：131-134.

〔5〕Sani M，Botteaux A，Parsot C，et al.IpaD is localized at the tip of the Shigella flexneri type III secretion apparatus〔J〕. Biochim Biophys Acta，2007，1770（2）：307-311.

〔6〕Hamiaux C，Van E A，Parsot C，et al.Structural mimicry for vinculin activation by IpaA，a virulence factor of Shigella flexneri〔J〕.EMBO Rep，2006，7（8）：794-799.

〔7〕Ramarao N，Le C C，Izard T，et al.Capping of actin filaments by vinculin activated by the Shigella IpaA carboxyl-terminal domain〔J〕.FEBS Lett，2007，581（5）853-857.

〔8〕Sansonetti P J.Microbes and Microbial Toxin：Parardigms for Microbial-Mucosal InteractinsⅢShigellosis：from symptoms to molecular pathogenesis〔J〕.Am J Physiol Gastointest Liver Physiol，2001，280（3）：319-323.

〔9〕Lunelli M，Lokareddy R K，Zychlinsky A，et al.IpaB-IpgC interaction defines binding motif for type III secretion translocator〔J〕.Biological Chemistry，2008，283：18646-18654.

〔10〕Shen D K，Saurya S，Wagner C，et al.Domains of the Shigella flexneri Type III Secretion System IpaB Protein Involved in Secretion Regulation.American Society for Microbiology〔J〕.Infect Immun，2010，78（12）：4999-5010.

（责任编辑 董杰）

Construction of the Recombinant Bb-ipaB Vaccine of Shigella flexneri

WANG Guofu,XUE Shipeng,BAI Li,WU Lixian
（Pre-clinical College,Dali University，Dali,Yunnan 671000,China）

Objective：To construct the recombinant Bb-ipaB vaccine of Shigella flexneri.Methods：ipaB gene was amplified by PCR and cloned into pGEX-1λT plasmid to construct pGEX-ipaB.The recombinant plasmid was electroporated into Bifidobacteria bifidum（Bb）to construct rBb-ipaB vaccine.Results：A 1 711 bp gene of ipaB was successfully amplified by PCR and cloned into pGEX-1λT by restriction analysis,and the rBb-ipaB vaccine was successfully constructed by PCR and restriction analysis.Conclusion：The rBbipaB vaccine of Shigella flexneri is successfully constructed,which lays the experimental foundation of exploitation and utilization of this vaccine.

Shigella flexneri；Bifidobacterium bifidum；recombinant Bb-ipaB vaccine;construction

R378.2+5

A

1672-2345（2013）03-0013-03

云南省教育厅基金重点项目基金资助项目（09Z0078）

2012-12-24

王国富，副教授，主要从事细菌疫苗研究.