陈蒙蒙，黑飞龙，吴 蓓，王世磊，秦春妮，杨胜男，王 晨，龙 村

非去极化心脏停搏液短时常温保存对猪冠状动脉内皮依赖性舒张功能的影响

陈蒙蒙，黑飞龙，吴 蓓，王世磊，秦春妮，杨胜男，王 晨，龙 村

目的探讨短时常温（1 h，37℃）条件下，非去极化心脏停搏液（NDP）对猪冠脉内皮源性超极化因子（EDHF）介导的血管舒张功能的影响。方法 根据保存液的不同，将血管环分成四组，分别为对照（CON）组、St.Thomas（ST）组、HTK组、NDP组。采用器官槽法，将血管环分别置于Krebs-Hensleit（KH）液、ST液、HTK液、NDP液中，37℃条件下保存1 h，加入一氧化氮合酶阻滞剂N-硝基-L-精氨酸（L-NNA）和环加氧酶阻滞剂（Indomethacin），记录由前列腺素F2α（U46619）及缓激肽（Bradykinin）引起的血管收缩和舒张反应。结果 NDP组中EDHF介导的内皮依赖性血管舒张百分比最大，为（74.79±6.40）％，其余依次为HTK组（51.32±21.92）％、CON组（24.03±8.01）％、ST组（16.20±6.39）％。结论 短时常温（1 h，37℃）条件下，NDP液对冠脉内皮的舒张功能具有保护作用，且优于HTK组、CON组和ST组。

血管环；保存液；内皮源性超极化因子

在冠脉循环系统中，内皮具有多种生理功能，尤其在调节血管张力方面发挥着关键的作用[1]。内皮主要通过释放内皮源性舒张因子调节血管张力，包括一氧化氮（nitric oxide，NO），前列环素（prostacyclin，PGI2）和内皮源性超极化因子（endotheliumderived hyperpolarizing factor，EDHF）[2]。研究发现临床广泛应用的高钾去极化停搏液严重损害血管内皮的舒张功能，主要影响EDHF介导的血管内皮依赖性舒张功能[3]。为了改善冠脉血管内皮的保护效果，课题组对原有停搏液进行改进，引入了“静息停搏”和“血管保护”的理念，设计出一种新型的“非去极化心脏停搏液（non-depolarizing solution，NDP）”。本研究应用一氧化氮合酶阻断剂L-NNA和环加氧酶阻断剂Indomethacin分别阻断NO和PGI2的作用，旨在探讨短时常温（1 h，37℃）保存条件下，NDP液对猪冠状动脉内皮EDHF介导的舒张功能的保护效果。

1 材料与方法

1.1 主要仪器 PowerLab八通道高速记录主机（澳大利亚ADInstruments公司），桥式放大器（澳大利亚ADInstruments公司），离体组织灌流装置（澳大利亚ADInstruments公司），高精度张力传感器（澳大利亚ADInstruments公司），恒温循环水浴（英国TECHNE公司）。

1.1 实验试剂 一氧化氮合酶阻断剂N-硝基-L-精氨酸（L-NNA，美国sigma公司），环加氧酶阻断剂吲哚美辛（Indomethacin，美国sigma公司），前列腺素F2α（U46619，美国Cayman公司），缓激肽（Bradykinin，美国sigma公司）。

1.3 溶液配制 Krebs-Hensleit（KH）液（mmol/L）：NaCl 118.5，KCl 4.75，MgSO41.19，KH2PO41.18，NaHCO325.0，CaCl21.4，葡萄糖11.0，pH 7.4。St.Thomas（ST）液（mmol/L）：NaCl 110，KCl 16，CaCl 1.2，NaHCO325，pH 7.8。Histidine-Tryptophan-Ketoglutarate（HTK）液（mmol/L）：NaCl 15，KCl 9，MgCl2· 6H2O 4，甘露醇30，L-组氨酸180，组氨酸盐酸18，色氨酸2，α-酮戊二酸钾盐1，pH 7.3。NDP液（mmol/L）：NaCl 15，KCl 5，MgCl2·6H2O 4，L-组氨酸180，组氨酸盐酸18，色氨酸2，α-酮戊二酸1，棉子糖30，谷光甘肽3，腺甘0.2，利多卡因0.5，尼可地尔0.01，pH 7.4。

1.4 实验对象 猪心，600～800 g。

1.5 实验分组及模型建立 根据保存液的不同实验分为四组，分别为对照（CON）组、ST组、HTK组、NDP组。于附近的屠宰场获取新鲜猪心，置于4℃冷KH液中迅速带回实验室。分离冠脉的左前降支，取中下1/3段截取成若干段2.2～2.8 mm，长度5 mm左右的血管环。保证每次实验中，四种不同保存液组的血管环来自同一猪心冠脉左前降支，每组样本量（n＝8）相同。将血管环悬挂在一对三角形不锈钢丝上，置于盛有37℃、经95％O2+5％CO2混合气体饱和的KH液的玻璃浴槽中固定。缓慢调节血管环的静息张力，使其在2.5 g左右达到平衡。平衡1 h后，将血管环分别浸泡于37℃的KH液、ST液、HTK液、NDP液，保存1 h。保存时间到后，用37℃KH液更换不同保存液，平衡30 min，加入7 μmol/L Indomethacin和300 μmol/L L-NNA，水浴30 min后，加入30 nmol/L U46619收缩血管，20 min左右达到平台，依次加入终浓度为10-10mol/L、10-9.5mol/L、10-9mol/L、10-8.5mol/L、10-8mol/L、10-7.5mol/L、10-7mol/L、10-6.5mol/L、10-6mol/L的Bradykinin舒张血管，每个浓度点之间的时间间隔为2 min，在每个浓度点测定血管张力。

1.6 观察指标 37℃条件下平衡1 h后，各组血管环静息张力（g）；各组保存1 h后的血管张力及变化幅度（g）；加入阻断剂Indomethacin和L-NNA 30 min后血管张力的改变（g）；各组加入U46619后血管的收缩幅度；不同浓度Bradykinin引起的EDHF介导的内皮依赖性舒张百分比（占U46619收缩幅度的百分比）。

1.7 统计学方法 使用SPSS 18.0软件对数据进行统计分析，数据采用均数±标准差（）表示。采用随机区组设计方差分析对数据进行统计分析，各组间两两比较采用Student-Newman-Keuls检验。所有计量数据检验前均经方差齐性和正态分布检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同的停跳液保存1 h后血管静息张力的改变 平衡期各组血管环静息张力无显著差异。37℃保存1 h后，CON组、HTK组静息张力几乎没有改变，ST组静息张力有所增加，NDP组静息张力显著下降，见图1。

图1 各组保存1 h后静息张力改变

2.2 加入阻断剂后血管张力的改变 各组加入阻断剂Indomethacin和L-NNA 30 min后血管静息张力均有所增加，与ST组、HTK组相比，NDP组张力变化幅度明显减小，见图2。

图2 各组加入阻断剂Indomethacin和L-NNA 30 min后静息张力改变

2.3 加入U46619收缩血管，记录最大血管收缩张力 不同的停搏液组中加入收缩剂U46619后，血管环的张力均明显增加，但各组比较无显著统计学差异，见图3。

图3 各组加入血管收缩剂U46619后血管张力的改变

2.4 Bradykinin介导的内皮依赖性血管舒张作用

在各组不同的停搏液中，依次加入10-10～10-6mol/L浓度的Bradykinin，随Bradykinin浓度的增大，血管舒张幅度也逐渐增大，其中NDP组中Bradykinin引起的EDHF介导的内皮依赖性血管舒张百分比最大，其次分别为HTK组、CON组、ST组，见图4。

图4 不同浓度Bradykinin引起的EDHF介导的内皮依赖性血管舒张百分比

3 讨 论

近年来很多研究提示传统的高钾停搏液会损害冠脉血管内皮的功能[3-5]，而内皮的完整性对维持正常的心功能至关重要[6-7]，因此，研究不同心脏停搏液对血管内皮的保护作用非常重要。内皮主要释放三种内皮源性舒张因子，包括NO，PGI2和EDHF，EDHF在冠脉血管张力的调节中发挥着重要的作用，尤其是当NO和PGI2的作用受损时，EDHF的作用会代偿性增强，从而维持血管张力的稳定。本研究应用阻断剂Indomethacin和L-NNA分别阻断PGI2和NO的作用，主要探讨新型非去极化心脏停搏液，即NDP液对EDHF介导的血管内皮依赖性舒张作用的影响。

不同的心脏保存液成分对血管的静息张力会产生不同的影响。本研究中，血管环在常温保存1 h后，CON组和HTK组血管张力变化不大，而ST组血管环的静息张力明显增高，升高幅度为（0.1276± 0.0412）g，NDP组的血管静息张力明显下降，下降幅度为（0.3445±0.0884）g。加入阻断剂Indomethacin和L-NNA后，发现各组血管环静息张力均有所增加，其中ST组血管张力增加的幅度最大，为（0.2734±0.0914）g，而NDP组血管张力增加的幅度最小，为（0.0987±0.1146）g。以上结果均提示ST液会引起冠脉血管的收缩，与Dong等的研究结果结果相一致[8]，而NDP液能够较好地维持血管张力的稳定。

不同作用原理的保存液对血管的收缩和舒张功能的影响也不相同。先使用U46619对血管环进行收缩，各组血管环收缩幅度无显著性差异。随后，依次加入不同浓度（10-10～10-6mol/L）Bradykinin。随着Bradykinin浓度的增加，EDHF介导的血管内皮依赖性舒张百分比逐渐增大，其中NDP组和HTK组血管舒张百分比明显升高，而ST组、CON组随Bradykinin浓度的升高，血管的内皮依赖性舒张反应性相对下降，且ST组低于CON组，提示短时常温（1 h，37℃）保存时，NDP液和HTK液能够较好地保护血管的舒张功能，而ST液对EDHF介导的血管内皮依赖性舒张功能具有损害作用，其中主要是高浓度钾离子的作用[8]。

本研究的结果显示，不同停搏液对血管静息张力以及EDHF介导的血管内皮依赖性舒张功能的影响不同，这可能与各种停搏液的成分不同有关。与CON组、HTK组、NDP组相比，ST组中血管静息张力明显增加，EDHF介导的血管内皮依赖性舒张作用明显受损。多项研究证实传统高钾停搏液损害血管内皮功能，尤其是损害EDHF介导的内皮依赖性舒张作用，原因主要体现在如下两方面[3-5]：首先，EDHF通过使细胞膜电位超极化发挥作用，而高浓度K+使平滑肌细胞膜电位去极化，抑制了EDHF介导的舒张作用；其次，EDHF通过开放K+通道使平滑肌细胞膜电位超极化，尤其是Ca2+离子激活的K+通道和ATP敏感性K+通道，而高浓度K+会对这些K+通道产生抑制作用。

与CON组、ST组相比，HTK组对血管静息张力的影响较小，也能较好地保护EDHF介导的内皮依赖性血管舒张作用。Pizzicannella等[9]应用免疫组织化学方法和超微结构分析证明，与生理盐水相比，HTK液对内皮细胞具有更好的保护效果。HTK液对血管内皮功能有较好的保护效果，可能与其成分特点相关[10-11]：K+浓度为9 mmol/L，稍高于K+的生理浓度，对血管内皮的影响较小；细胞外低钠可以减轻内皮细胞水肿，微钙有利于保护血管的舒张功能；组氨酸/组氨酸盐缓冲系统能够减轻缺血期间的细胞酸中毒。

NDP液为非去极化型心脏停搏液，K+浓度为5 mmol/L，低于ST液和HTK液，处于K+的生理浓度范围之内。与其它三组相比，NDP组能够轻微降低血管静息张力，不引起血管的收缩反应，并且其保护EDHF介导的内皮依赖性血管舒张功能的效果最优。分析NDP液组成，其血管保护作用优于其它三组的主要原因是：腺苷、利多卡因和尼可地尔可将细胞膜电位钳制在静息电位水平，抑制了电压依赖性Ca2+通道的开放，减少了钙内流和细胞内储存钙释放，从而能够有效维持血管的静息张力，保护血管内皮舒张功能。其中，腺苷通过与腺苷受体结合激活ATP敏感性K+通道发挥心血管保护作用[12]，Jakobsen等[13]应用腺苷取代停搏液中高浓度K+，发现腺苷能够保护EDHF介导的内皮依赖性舒张作用；Dong等[14]研究证明尼可地尔能够改善停搏液对血管内皮的保护效果，保护EDHF介导的内皮依赖性舒张作用，可能机制为其开放ATP敏感性K+通道，使平滑肌细胞膜电位超极化，与EDHF的作用协同，从而保护了EDHF介导的内皮依赖性舒张作用。

实验结果表明，短时常温（1 h，37℃）保存后，NDP液具有良好的血管内皮保护效果，其作用明显优于CON组、ST组和HTK组。NDP液可使平滑肌细胞膜电位超极化，促进EDHF的释放，保护了EDHF介导的血管内皮依赖性舒张功能。此外，组氨酸缓冲系统、抗氧化剂谷胱甘肽、非渗透物质棉子糖的加入，进一步增强了血管保护效果。NDP液血管保护的特点弥补了传统高钾停搏液损害血管内皮功能的不足，更符合理想心脏停搏液的特点，既满足了心脏外科手术的要求，又极大程度地改善了心脏的保护效果。但目前NDP液的研究还处于基础研究阶段，还需要进一步的临床研究证实，从而为NDP液的临床应用奠定坚实的基础。

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The protective effect of non-depolarizing solution on the endothelium-related relaxation of porcine coronary arteries under normal temperature

Chen Meng-meng，Hei Fei-long，Wu Bei，Wang Shi-lei，Qin Chun-ni，Yang Sheng-nan，Wang Chen，Long Cun
Department of CPB，State Key Laboratory of Cardiovascular Disease，Fuwai Hospital，National Center for Cardiovascular Disease，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100037，People＇s Republic of China

Hei Fei-long，Email：heifeilong＠126.com

ObjectiveThe present study was designed to evaluate the protective effect of non-depolarizing solution（NDP）on the endothelium-derived hyperpolarizing factor（EDHF）-mediated relaxation of porcine coronary arteries after rings were incubated with NDP solution at 37℃for 1 hour.MethodsDue to different preservation solutions used in different groups，the rings were divided into four groups：control（CON）group，St.Thomas（ST）group，Histidine-Tryptophan-Ketoglutarate（HTK）group and NDP group.Rings from porcine coronary arteries were studied in the organ chamber.After equilibration，the rings were incubated with Krebs-Helenseit solution in CON group，St.Thomas solution in ST group，HTK solution in HTK group，non-depolarizing solution in NDP group at 37℃for 1 hour.Then Pre-contraction tone induced by prostaglandin F2α（U46619）and endothelium-dependent relaxation tone induced by bradykinin was measured in the presence of indomethacin and L-NNA.ResultsAfter incubation with different solutions at 37℃for 1 hour，the EDHF-mediated relaxation induced by bradykinin was much higher in the NDP group 74.79％±6.40％ than in the HTK group 51.32％±21.92％，CON group 24.03％±8.01％and ST group 16.20％±6.39％.ConclusionNDP solution provides superior endothelium protective effect compared with ST and HTK solution under normal temperature.

Vascular rings；Preservation solutions；Endothelium-derived hyperpolarizing factor

R654.1

A

1672-1403（2013）04-0252-05

2013-08-01）

2013-08-29）

国家自然科学基金资助项目（30972866）

北京市自然科学基金资助项目（7102131）

100037北京，北京协和医学院，中国医学科学院，国家心血管病中心，阜外心血管病医院，心血管疾病国家重点实验室，体外循环科

黑飞龙，Email：heifeilong＠126.com