邹新海 李全宏 王海涛 （江苏省邳州市畜牧兽医站 221300）

刘 娟 （江苏省邳州市动物卫生监督所）

关于血凝抑制试验中存在的十种问题及解决方法

邹新海 李全宏 王海涛 （江苏省邳州市畜牧兽医站 221300）

刘 娟 （江苏省邳州市动物卫生监督所）

随着人们对动物源性食品质量卫生安全要求的日益提高和动物防疫检疫工作的需要，实验室检验成为基层动物防疫检疫机构的必要技术手段。某些病毒(如新城疫、禽流感病毒等)具有凝集某种动物红细胞的现象，这种现象可被特异性免疫血清所抑制，即为红细胞的血凝抑制。在基层工作中，微量血凝抑制试验 (HI)广泛应用于禽流感、新城疫、产蛋下降综合征和传染性支气管炎等母源抗体的检测、雏鸡首免日龄的确定、疫苗免疫后免疫应答的监测、临床鸡病的鉴别诊断等。血凝抑制试验是一种简便、快速、灵敏、准确且常用的血清学诊断方法。但不规范的试验操作常常常由于某些因素的影响，使试验结果不精确，有时甚至无法判定结果。下面把本人在试验中遇到的问题及解决方法作一总结。

1 红细胞采集方法不当

由于不同个体鸡只红细胞对病毒的敏感性不同从而影响HI效价，所以一般需要采取3只以上公鸡红细胞混合一起用，最好用非免疫公鸡，实验室应准备3～4只无特定免疫公鸡，采血时，先用无菌的方法将一定比例的抗凝剂抽到采血器中，再去采血(一般采用翅静脉采血)，将采出的3～4份鸡血混合、离心，制备1%鸡红细胞。避免先采血后加抗凝剂，加入时间、方法不当易产生血凝块，影响检测结果。翅静脉采鸡血时，由于血管较细，进针后抽取速度要缓慢，速度过快、过猛时，容易导致血液充盈度减小，流通不畅、不易抽取。采血前均先用酒精脱脂棉球消毒，，采血完毕后用脱脂棉按压1min左右，至不出血为止，避免造成血肿。

2 稀释液的pH值选用不当

稀释液的pH值对试验有影响，稀释液的pH值在5.8以下，红细胞易自凝；pH值7.8以上凝集的红细胞洗脱加快。因此应选用pH值为7.0～7.2的PBS液或灭菌生理盐水。

3 1%鸡红细胞的配制不当

一般配制应加生理盐水或PBS适量，目的是洗去血清及红细胞，防止红细胞溶血，离心的转速为1000转/min，时间为10min，洗涤次数3～5次，不应少于3次。离心结束后用吸管将上清液移去，切勿倒出去。离心好的红细胞用吸管小心吸取，不能反复吹吸，以免造成红细胞组织破坏，所余的红细胞用生理盐水或PBS稀释100倍，放置4℃备用。

4 被检血清的保存不当

被检血清腐败变性严重影响免疫抗体检测。因此，血样采集后要及时分离血清，分离后及时测定或放置在4℃冰箱内保存，要力求新鲜，如暂时不测定可冷冻保存，血清使用前要充分摇匀。

5 病毒悬液和红细胞悬液在使用前没有摇匀

病毒悬液和红细胞悬液如没有摇匀，加入时浓度高低不一，会造成人为误差。抗原和红细胞使用前一定要振荡摇匀，保证每一孔中加入的浓度准确一致。

6 4血凝单位(HAU)抗原配制不准确

4个HAU抗原要现用现配，混悬液要混匀，配好的抗原室温下放置不得超过4个h，不可反复冻融。为防止4个HAU抗原配制不准确.在作HI试验前必须做4IU抗原校正。在微量反应板的1～4孔均加入0.025ml生理盐水。取4IU病毒液0.025ml加入第1孔内，混匀后吸取0.025ml加入第2孔，依次倍比稀释至第4孔，从第4孔吸取0.025ml弃之。每孔均加入0.025ml1%鸡红细胞悬液，轻轻混匀，室温(20～25℃)下静置40min后观察结果。若有2孔凝集，则视为抗原配制正确。若1孔凝集、2孔以后均沉淀，则抗原配制浓度偏低，若前3孔均凝集、第4孔沉淀，则抗原配制浓度偏高。否则，需重新测定抗原效价，重新配制4个HAU抗原，并作4IU抗原校正，直至结果准确。

7 4IU抗原和1%红细胞的配制和用量不当

配制好的4IU抗原在2～8℃保存条件下，3d内效价基本无变化，1%红细胞在2～8℃保存条件下，3d内不会发生溶血。超过3d，4IU抗原和1%红细胞会因自身效价降低和溶血而影响实验结果。因此，每次实验前要根据待测样品数量计算一下本次实验需要多少的4IU抗原和1%红细胞，适当配置，避免因多配而引起浪费。加入4IU病毒时应该从稀释倍数高的孔向稀释倍数低的孔依次加入(即从后向前加)，避免滴加过程中移液枪头被污染。振荡的时间不能过短，一般不少于1min。

8 温度控制、读数时间不当

一般是由于环境温度低，或反应作用时间短，结果还没有完全显示。在环境温度20～25℃，经过20～30min即可读出抗原效价和血清抗体滴度。当温度过低，如低于15℃时，出现结果就要慢，往往需要超过40min才能出现清晰的结果。需静置一段时间后再读数。此时，亦可用恒温培养箱来或室内控制温度和时间以保证实验的正常进行。

9 最佳温度及读数时间

试验过程中的环境温度超过30℃时，试验结果出现的要快。往往在15min左右就可读数。一旦时间过长，结果就会消失，使整板无凝集现象，给人一种误以为效价为0，或抗体滴度为12log2。故要求试验环境温度不得超过30℃，应及时读数，不应长时间拖延读数时间。

10 注意微量血凝板的清洗对试验结果的影响

目前，实验单位和基层多使用一次性96孔V型板，使用后不用清洗。若使用玻璃材料的96孔凝集板，在试验结束后要按程序清洗干净：试验完毕即将凝集板应及时置水龙头下冲净血球(压力大的水龙头最好)，用自来水反复冲洗，再用含洗涤剂的温水溶液浸泡30min，并在洗涤剂溶液中以棉拭子刷洗凹孔及板面，不能用尖硬的器具清除沉淀在孔底的污垢，待反应板干燥后，放到25%～3%浓度的盐酸中浸泡24h以上，捞出用自来水冲洗多次，最后以蒸馏水或超纯水冲洗2～3次，在37℃温箱中烘干备用，将血凝板正对日光灯，孔底光洁透明无可见沉淀附着物为准。

总之，在进行微量血凝抑制试验中，操作程序一定要规范、细致耐心，综合考虑各方面的因素，发现问题及时纠正处理，才会获得满意的实验结果以正确评价疫苗免疫的效果及辅助诊断病毒性疾病。

S851.4

C

1007-1733(2013)03-0042-02

2013–01–14）

调查报告