李 龙

(长江大学医学院，湖北荆州434023)

王 梦，杜天幸 蔡志强，杨继元

(长江大学临床医学院 荆州市肿瘤医院，湖北荆州434000)

肺癌是全球恶性肿瘤导致死亡的最主要原因，每年有超过100万人死于肺癌［1］。肺癌全球每年新增病例约160万，其中非小细胞肺癌 (NSCLC)约占80%。虽然化疗仍是晚期肺癌治疗的主要方法之一，但其副作用大，且疗效已遇瓶颈。随着EGFR、VEGFR等研究的不断深入，以这些特殊分子的靶向治疗，因其毒性小，疗效突出，现已成为肺癌治疗的新热点。近几年在非小细胞肺癌发现的棘皮动物微管相关蛋白样4和间变淋巴瘤激酶融合基因 (EML4-ALK)可能成为继EGFR、VEGFR后新的研究热点。现就EML4-ALK的结构及亚型、检测方法、针对该靶点的最新治疗情况以及耐药状况进行综述。

1 EML4-ALK融合基因的结构及亚型

棘皮动物微管相关蛋白样4(EML4)与间变淋巴瘤激酶两基因均位于2号染色体短链，分别为P21与P23。2007年，Soda1［2］等将一腺癌患者手术肿瘤切除组织进行扩增，在产物中发现一3296bp组成的DNA，其编码由1059个氨基酸组成的蛋白质。研究人员对其蛋白质进行分析发现其N端为EML4编码蛋白的一部分，C端为ALK编码蛋白一部分。故推测其为两基因的融合蛋白。Lin［3］等研究发现EML4-ALK融合基因阳性非小细胞肺癌细胞株通过siRNA基因敲除沉默后其生长受抑制，表明ELM4-ALK融合基因具有致癌作用。

到目前为止有超过9个不同的EML4-ALK融合基因变体已经被确认。融合基因的ALK段固定，均为20-29外显子片段，与EML4外显子13融合成变体1(variant1)。它与EML4外显子20融合成变体2(variant2)。它与外显子6融合成变体3a(variant3a)，外显子6及11个氨基酸插入形成变体3b。外显子14及14个未知来源的核苷酸插入至ALK外显子核苷酸50序列区形成变体4(variant4)。它与EML外显子2形成变体5(variant5)，与外显子13形成变体6(variant6)。外显子14融合至ALK核苷酸13序列区形成变体7(variant7)，外显子15与ALK融合形成变体8(variant7)，外显子18与ALK融合形成变体9(variant9)［4］。9种变体中，最长见的是变体1与变体3，分别占到33%和29%。不同变体在非小细胞肺癌中的作用机制及其作用强度是否有区别暂时没有报道。

2 NSCLC中的EML4-ALK

Gung Jin［5］等用 RT-PCR对167例肺癌标本 (121例腺癌，46例鳞癌)进行研究，发现10例(6%)EML4-ALK融合基因阳性，阳性病例在年轻患者更常见 (10.8%VS89.2%，P=0.002)，融合基因更集中表现在女性、非吸烟、腺癌患者中。10例EML4-ALK患者的EGFR、KRAS均为野生型，其中8例为EML4-ALK变体1型，2例为变体3型。

Aliced［6］等采用荧光原位杂交对141例NSCLC病例 (89例腺癌、41例细支气管肺泡癌、4例腺鳞癌、2例鳞癌、5例大细胞癌)进行研究，发现19例 (13%)EML4-ALK融合基因阳性，31例 (22%)EGFR突变型，91例EGFR、EML4-ALK双野生型。对EML4-ALK融合基因阳性患者与EGFR突变型以及双野生型比较，三组平均年龄分别是52、66、64岁，EML4-ALK融合基因阳性患者更年轻 (P＜0.001，P=0.005)。EML4-ALK融合基因阳性患者与EML4-ALK、EGFR双野生型患者比较，EML4-ALK(+)更倾向发生在不抽烟者 (P＜0.001)。EML4-ALK(+)患者其EGFR基因型均为阴性，没有重叠。

Wong［7］等采用RT-PCR及免疫组化对266例 NSCLC患者进行分析 (adenocarcinomar209例、lymphatic epithelial carcinoma11例、squamous cell carcinoma 34例、mucosal epithelia carcinoma 12例)发现EML4-ALK融合基因13例 (4.9%)，其中吸烟者1例，不吸烟者12例，EML4-ALK(+)更倾向发生于不抽烟者 (P=0.009)，EML4-ALK(+)与EGFR(+)及KRAS(+)不重叠。EML4-ALK(+)平均年龄为59岁，EML4-ALK(-)平均年龄为64岁，EML4-ALK融合基因更倾向于发生年龄较轻者(P ＜0.018)。

EML4-ALK融合基因更倾向于发生于肺腺癌，但鳞癌、肺鳞癌、大细胞癌均有研究者报道，不吸烟、年轻、女性的、EGFR(-)、KRAS(-)群体其EML4-ALK发生率更高。

3 EML4-ALK融合基因的检测方法

3.1 逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR)

RT-PCR在检测NSCLC EML4-ALK融合基因方面具有敏感性高的特点，但往往医院的病理标本均经甲醛固定，其细胞内RNA被大量破坏，导致其灵敏性降低。逆转录聚合酶链反应一般采用单管多重技术，所以其对未知亚型无法检出［8］。并且采用PCR技术假阳性结果几率较其他方法几率增大［9］。

3.2 免疫组化 (IHC)

免疫组化是实验室经典的蛋白质检查方法，其应用于EML4-ALK融合基因的检测主要原理是检查融合基因表达蛋白。IHC检验结果与RT-PCR及FISH具有高度重叠性。但由于EML-ALK基因在肺组织表达不足［10］，低表达的EML-ALK往往被漏检，再者IHC不能对融合基因进行亚型分型［11］。

3.3 荧光原位杂交 (fluorescence in sure hybridization，FISH)

荧光原位杂交是采用基因探针来标记ALK两断裂端，如果为EML4-ALK融合基因，荧光显微镜下显现绿色和红色，如果为融合基因阴性，在荧光显微镜下显现黄色［12］。在采用免疫组化检测时，如果EML4-ALK融合基因表达弱阳性，IHC检测结果为阴性，若使用FISH检测法为阳性。由于FISH法的病理标本均经甲醛固定石蜡包埋，其细胞组织、细胞结构广泛被破坏，易出现假阳性。Thunnissen［13］等研究发现经免疫组化检测为阳性采用FISH检测假阴性。

3.4 其他方法

现在没有检测EML4-ALK的金标准，RT-PCR、IHC、FISH各有利弊，IHC与FISH不能区分亚型变体，RT-PCR理论上可以区分已知亚型，但是不能检测出未知亚型。RACE-PCR技术解决了RT-PCR不能区分未知亚型变体的问题，并且能检测出其他与ALK融合的基因［14］。

4 针对EML4-ALK融合基因的治疗现状

ALK与EML4基因融合后，导致ALK胞内酪氨酸酶区持续活化，促进细胞的增殖，导致细胞癌变。这为研发阻断ALK受体，阻止其持续活化的分子靶向药物提供了理论基础。Soda［2］等研究发现肺上皮细胞表达EML4-ALK融合基因的转基因小鼠最终发展成肺腺癌，表明ALK融合基因具有癌基因特性。不同研究均发现，在NSCLC表达EML4-ALK融合基因的细胞株进行研究，ALK抑制剂可以通过抑制ALK融合基因的相关信号通路起到抑癌作用［15-16］，其抑癌机制与EGFR抑制剂类似。ALK抑制剂已经在体内进行评估起到良好的疗效，并且作用于产生EML4-ALK的非小细胞肺癌的异种移植小鼠，导致肿瘤的有效消退。PF-02341066(crizotinib)是目前唯一进入III期临床试验的药物［17］，这种口服的生物可利用的小分子抑制剂已被证明能够抑制EML4-ALK(+)细胞株。GSK2141795现已经进入一期临床阶段，NVP-TAE684、CEP-28122、AP-26113、NMS-E628已进入临床前试验。

Lazarev I［18］等诊治一36岁非吸烟的非小细胞肺癌，化疗失败，EML4-ALK融合基因阳性，后给予Crizotinib口服300mg/日，治疗两月后评价治疗缓解。Wang［19］等报道于就诊的1500例非小细胞肺癌患者中检测出含有ALK重排融合基因患者，采用Crizotinib口服治疗，如果有效并且稳定则继续治疗，如果疾病进展则停止服药，其平均治疗时间为6.2月。其中CR(完全缓解)数:1例，PR(部分缓解)数:46例，并且NC(并且稳定)数:27例。

Zhang［20］等报道，一非小细胞肺癌患者，检测EML4-ALK融合基因阳性，口服crizotinib 5月后，发现病情进展，取肺癌组织做基因分析，发现其融合基因有两处突变 (4374与4493序列区)，基因点突变后，ALK融合蛋白结构发生改变与crizotinib亲和力下降。培养crizotinib耐药癌细胞株，将TAE684作用于此细胞株，发现细胞株生长受抑制。Heuckmann［21］等研究表明不同EML4-ALK融合基因变体对ALK抑制剂的敏感性不同，HSP90对EML4-ALK融合基因阳性非小细胞肺癌细胞系也有抑制作用，与ALK抑制剂一样，不同变体对其敏感性存在差异性，但其耐受机制不一样，将ALK抑制剂与HSP90联合使用，具有更强的抑制效果。

5 结 语

现阶段化疗及放射治疗仍是晚期非小细胞肺癌患者的主要治疗手段，但由于其疗效欠佳，毒副作用大，人们渴望一理想的治疗手段，分子靶向治疗是一个不错的研究方向。EML4-ALK可能是继EGFR、VEGFR后又一新的治疗靶点。目前对于EML4-ALK融合基因的研究我们主要面临以下几个问题:①EML4-ALK融合基因发生率低，研究时需要样本量大，现缺乏大样本量的研究报告。②RT-PCR、IHC、FISH各有优缺点，联合检测可以互补。暂时没有检测EML4-ALK的金标准。③EML4-ALK融合基因通路机制尚未完全清楚，它们之间是否相互联系及权重关系有待进一步研究，待通路机制研究透彻，针对主要通路机制或者联合通路机制的药物更具有针对性。以上3个问题将是以后研究的主要方向，以EML4-ALK为治疗靶点将是治疗NSCLC的新希望。

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