陈良恩，吴峰，辛益妹，赵安东，王永新，詹皓

现代高性能战斗机在机动飞行中所产生的正加速度(+Gz)具有高G值、快增长率、长持续时间以及反复出现等特点，高+Gz暴露引起的心脏改变对飞行员的身心健康和飞行安全具有潜在威胁[1]。动物实验证实，重复高强度+Gz暴露可导致肌原纤维变性、线粒体肿胀、溶酶体破裂以及闰盘结构解离等多种超微结构损伤[2-4]。+Gz暴露对心肌的损伤除了机械性作用外，+Gz作用下的强烈应激反应、心肌缺血缺氧以及氧自由基大量生成也是导致心肌损伤的重要因素[5-6]。

近年来，中草药在氧自由基清除以及对抗心肌缺血缺氧损伤等方面的作用受到越来越多的关注。本研究采用的复方中药天芪航力片主要由红景天、黄芪、当归、白芍、丹参等成分组成，具有清除氧自由基、改善微循环及心血管功能、增强免疫力、提高机体抗应激能力等作用。我们曾研究报道过天芪航力片对持续高+Gz应激所致大鼠心、脑损伤的防护效果[7-8]。在本研究中，我们利用动物离心机模型，通过观察该复方中药制剂对大鼠心肌线粒体呼吸功能、抗氧化能力和ATP酶活性的影响，进一步探索天芪航力片对高+Gz应激致大鼠心肌损伤的防护效果及其可能机制，以期为利用中药复方制剂提高飞行员加速度耐力的研究提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 健康成年雄性SD大鼠72只，体重200±25g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。将大鼠随机分为空白对照组、应激对照组、高+Gz应激组、复方低剂量组、复方中剂量组和复方高剂量组，每组12只，各组动物分笼饲养并做标记。各组动物每天上午灌胃给药1次，连续14d，给药体积为20ml/kg，每只动物每天灌胃前称取体重以确定灌药量，复方低剂量组、复方中剂量组和复方高剂量组大鼠分别按0.75、1.5和3.0g/kg给予天芪航力片制剂(由中国医学科学院药用植物研究所化学室提供)，其余3组动物每天给予等量生理盐水。末次给药当日20:00开始禁食，次日进行离心机暴露。

1.2 动物离心机暴露 采用动物离心机进行+Gz暴露。将大鼠束缚固定在通气的动物舱中，置于离心机转臂上，大鼠头部朝向离心机旋转轴心，离心机半径2m，由计算机进行加速度程序控制。空白对照组不做任何处理；应激对照组动物在离心机舱内转臂上束缚5min，不做离心处理；其余实验组大鼠+10Gz暴露，持续5min，加速度增长率为1G/s。

1.3 心肌线粒体制备 大鼠高+Gz应激后4h麻醉，速取心脏，用4℃生理盐水冲洗，取每只大鼠左室心尖部心肌组织，置于预冷的分离介质(0.25mol/L蔗糖、0.01mol/L Tris-HCl，pH7.4)中洗去血液，充分剪碎、匀浆。采用差速离心法分离线粒体。以700×g离心7min，弃沉淀；上清经10 000×g离心10min，弃上清；用分离介质悬浮沉淀，以同样高速离心1次，以分离介质悬浮沉淀，制成线粒体悬液，调整蛋白浓度在10~20mg/ml。以上操作均在0~4℃进行。

1.4 心肌组织线粒体呼吸功能的测定 采用Clark氧电极法测定心肌线粒体呼吸功能[9]。反应总体积2.5ml，温度30℃，将2.4ml反应介质(0.25mol/L蔗糖，0.01mol/L Tris-HCl，0.1%BSA，0.5mmol/L EDTA，3mmol/L KH2PO4，pH7.4)加入反应池中孵育2min，然后加入线粒体悬液(0.1ml)至终浓度0.4mg/ml，记录一段基线(1~2min)，待内源底物耗尽，基线基本平直，加入底物琥珀酸钠至终浓度5mmol/L(10μl)，测量变2min，加入ADP至终浓度180μmol/L(9μl)，测量变10min。观察线粒体呼吸态的变化，记录氧耗曲线，计算在ADP加入后[Ⅲ态呼吸(state 3 respiration，ST3)]和ADP耗尽后[Ⅳ态呼吸(state 4 respiration，ST4)]的氧耗量。呼吸控制率(respiratory control ratio，RCR)以Ⅲ、Ⅳ态耗氧之比(ST3/ST4)表示。

1.5 心肌线粒体抗氧化能力及ATP酶活性测定取制备好的线粒体悬液，用超声粉碎机使线粒体破碎，BCA法测定蛋白含量，测定试剂盒购自北京赛驰生物科技有限公司，测定步骤按照试剂盒说明书进行。过氧化氢酶(catalase，CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性及丙二醛(MDA)含量检测均采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒完成，测定步骤按照试剂盒说明书进行。

1.6 统计学处理 采用SPSS 16.0软件进行统计学分析，数据结果以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠心肌线粒体呼吸功能的变化 高+Gz应激组大鼠心肌线粒体ST3和RCR明显低于空白对照组和应激对照组(P<0.01)，而ST4明显高于空白对照组(P<0.05)，说明高+Gz应激会损伤大鼠线粒体的呼吸功能。复方中药天芪航力片预处理后大鼠ST3和RCR升高，且呈现剂量依赖关系。复方高剂量组大鼠心肌线粒体ST3和RCR明显高于高+Gz应激组(P<0.01)，ST4在高+Gz应激组和复方中药处理组间差异无统计学意义(表1)。

2.2 各组大鼠心肌线粒体抗氧化能力的变化 与空白对照组和应激对照组相比，高+Gz应激组大鼠心肌线粒体SOD、GSH-Px活性明显降低(P<0.05或P<0.01)，MDA含量显著升高(P<0.01)，提示高+Gz应激会导致线粒体抗氧化酶的活性降低，脂质过氧化反应增强。复方中药天芪航力片以剂量依赖方式提高CAT、SOD和GSH-Px的活性，降低MDA的含量。复方高剂量组大鼠心肌线粒体抗氧化酶活性明显高于高+Gz应激组(P<0.05或P<0.01)，MDA含量不但低于高+Gz应激组，还明显低于空白对照组和应激对照组(P<0.01，表2)。

2.3 各组大鼠心肌线粒体Na＋-K＋-ATP酶、Ca2＋-ATP酶活性变化 如表3所示，高+Gz应激导致Na＋-K＋-ATP酶和Ca2＋-ATP酶活性降低，但只有Na＋-K＋-ATP酶与空白对照组或应激对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。复方中药天芪航力片能以剂量依赖方式提高ATP酶活性，复方高剂量组Na＋-K＋-ATP酶和Ca2＋-ATP酶活性都明显高于高+Gz应激组(P<0.01)，Ca2＋-ATP酶活性甚至高于空白对照和应激对照组(P<0.05)。

表1 各组大鼠心肌线粒体呼吸功能的比较(±s, n=12)Tab.1 Comparison of respiratory function of myocardial mitochondria in each group of rats (±s, n=12)

表1 各组大鼠心肌线粒体呼吸功能的比较(±s, n=12)Tab.1 Comparison of respiratory function of myocardial mitochondria in each group of rats (±s, n=12)

ST3. State 3 respiration; ST4. State 4 respiration; RCR. Respiratory control ratio. (1)P<0.05, (2)P<0.01 compared with blank control group; (3)P<0.05, (4)P<0.01 compared with stress control group; (5)P<0.05, (6)P<0.01 compared with high +Gz stress group

Group ST3(nmol·min-1·mg protein-1)ST4(nmol·min-1·mg protein-1) RCR Blank control group 36.38±8.18 12.08±2.47 3.16±1.11 Stress control group 32.93±8.87 13.46±3.82 2.55±0.71(1)High +Gz stress group 20.99±6.45(2)(4) 16.01±3.92(1) 1.42±0.73(2)(4)Low dose compound group 25.24±7.51(2)(3) 15.65±4.44(1) 1.65±0.44(2)(4)Medium dose compound group 27.86±9.90(1)(5) 15.41±5.91 1.90±0.59(2)(3)High dose compound group 33.97±4.33(6) 14.58±3.49 2.45±0.67(1)(6)

表2 各组大鼠心肌线粒体抗氧化酶活性和MDA含量的比较(x±s, n=12)Tab.2 Comparison of antioxidase activity and MDA content of myocardial mitochondria in each group of rats (x±s, n=12)

表3 各组大鼠心肌线粒体ATP酶活性比较(U/mg protein,±s, n=12)Tab.3 Comparison of ATPase activity of myocardial mitochondria in each group of rats (U/mg protein,±s, n=12)

表3 各组大鼠心肌线粒体ATP酶活性比较(U/mg protein,±s, n=12)Tab.3 Comparison of ATPase activity of myocardial mitochondria in each group of rats (U/mg protein,±s, n=12)

(1)P<0.05 compared with blank control group; (2)P<0.05 compared with stress control group; (3)P<0.05, (4)P<0.01 compared with high +Gz stress group

Group Na＋-K＋-ATPase Ca2＋-ATPase Blank control group 2.63±0.52 2.18±0.59 Stress control group 2.56±0.23 2.14±0.49 High +Gz stress group 2.14±0.46(1)1.79±0.41 Low dose compound group 2.50±0.79 2.48±0.67(3)Medium dose compound group 2.47±0.58 2.59±0.79(3)High dose compound group 2.91±0.54(4) 2.67±0.63(1) (2) (4)

3 讨 论

无论是高+Gz作用导致的心肌缺血缺氧，还是机体强烈的应激反应，均可引起心肌细胞的自由基代谢异常、能量代谢障碍以及离子平衡紊乱，损伤心肌细胞的结构和功能[10]。心肌线粒体是心肌细胞的能量代谢中心，同时也是氧自由基产生的主要部位，在高+Gz暴露损伤心肌细胞的过程中，线粒体首当其冲。

有氧呼吸是线粒体能量产生的主要过程。在线粒体呼吸过程的5个状态中，比较重要的是ST3和ST4。ST3反映ADP和呼吸底物同时存在时的快速氧化过程，当ADP耗尽，线粒体呼吸进入ST4，ST4反映线粒体膜通透性的大小[11]。RCR是测量底物氧化和磷酸化偶联的指标，可反映线粒体结构完整性和氧化磷酸化偶联程度[12]。高+Gz应激大鼠心肌线粒体呼吸功能参数的变化说明线粒体氧化磷酸化功能受损，氧利用效率降低，ATP产生减少。复方中药天芪航力片可以提高大鼠ST3和RCR值，其中复方高剂量组ST3和RCR值明显高于高+Gz应激组，说明药物对高+Gz应激大鼠心肌线粒体呼吸功能损伤有明显的改善作用。

高+Gz应激导致心肌缺血缺氧以及儿茶酚胺类激素水平升高，从而使氧自由基的产生增多。体内氧自由基的清除主要有两种方式，一种是依赖抗氧化酶类的作用，一种是依赖谷胱甘肽、维生素C、维生素E、类胡萝卜素以及其他脂溶性抗氧化物。主要的抗氧化酶有SOD、GSH-Px及CAT。SOD催化超氧自由基生成氧和H2O2。GSH-Px负责清除氢过氧化物，催化氢过氧化物生成H2O2。因此，GSHPx可以保护膜脂质、蛋白和核酸不被氧化。CAT的主要作用是降解H2O2生成H2O和O2[13]。在本研究中，高+Gz暴露后过多的氧自由基导致了抗氧化酶活性的降低和MDA含量的升高。复方中药天芪航力片能够增强抗氧化酶的活性，复方高剂量组大鼠心肌线粒体抗氧化酶活性明显高于高+Gz应激组，SOD活性甚至高于空白对照组。由于氧自由基被清除，脂质过氧化反应被抑制，心肌线粒体MDA含量也相应降低。

无论是线粒体呼吸功能受损引起的ATP生成减少还是氧自由基产生增多导致的脂质过氧化反应均可影响线粒体膜上ATP酶的活性以及线粒体内外的离子转运[14-15]。本研究对Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶的检测结果也显示，高+Gz应激可诱导降低上述ATP酶的活性，但Ca2+-ATP酶活性在空白对照组、应激对照组及高+Gz应激组间差异无统计学意义，其原因可能与实验动物的数量较少有关。生理情况下，线粒体通过膜上Ca2+-ATP酶主动将Ca2+从胞质摄入线粒体基质，参与细胞代谢调节。当Ca2+-ATP酶活性下降时，线粒体摄取Ca2+减少，胞质中Ca2+增加时，细胞代谢受到影响，甚至死亡。Na+-K+-ATP酶与Ca2+-ATP酶共同维持线粒体容量、内外离子平衡和渗透压。Na+-K+-ATP酶活性降低可引起线粒体内Na+潴留，线粒体肿胀甚至破裂。复方中药天芪航力片能够明显提高线粒体Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性，有助于维持线粒体内外离子的平衡，避免和减轻离子转运障碍对线粒体以及心肌细胞的损伤。

总之，本研究结果显示复方中药天芪航力片可以改善线粒体呼吸功能、增强线粒体抗氧化能力、提高ATP酶的活性，对高+Gz应激导致的心肌线粒体功能损伤起保护作用。进一步研究复方中药的保护机制和临床效果，尽早将其应用于飞行人员，提高飞行人员的抗荷耐力，对于保证飞行安全具有重要意义。

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