张俊侠,马 玉,肖 禾,焦小珂

(1.成都大学医护学院,四川 成都 611137;2.四川中方制药有限公司,四川 广元 628000)

不同产地夏枯草药材HPLC指纹图谱研究

张俊侠1,马 玉1,肖 禾2,焦小珂2

(1.成都大学医护学院,四川 成都 611137;2.四川中方制药有限公司,四川 广元 628000)

目的:比较不同产地夏枯草药材HPLC指纹图谱,建立准确、稳定和可重复的夏枯草药材质量评价方法,为其质量控制提供参考.方法:采用高效液相色谱法,Shimadzu VP-ODS C18柱色谱柱;A相为1%醋酸,B相为甲醇组成的梯度洗脱液;检测波长290 nm;柱温30℃;流速1.0mL/min;分析时间60 min.结果:该方法可以使夏枯草中的各成分较好分离,并根据检测结果确定了14个共有峰,进行相似度评价,10批药材中有2批药材与对照指纹图谱的相似度较小,分别为0.133和0.062,其余8批均达到0.850以上,说明不同产地的夏枯草药材指纹图谱既有共性也具有一定的差异.结论:建立的不同产地夏枯草高效液相色谱职位图谱方法精密度高、重复性好,方法稳定可靠,可以有效地用于夏枯草原材料质量控制和鉴定.

夏枯草;HPLC;指纹图谱;质量控制

0 引 言

夏枯草为唇形科植物夏枯草的干燥果穗,具有清火、明目、散结、消肿之功效[1].研究表明,夏枯草主要含有三萜及其苷类、甾醇及其苷类、黄酮类、香豆素、有机酸、挥发油及糖类等成分[2].目前,夏枯草临床上主要用于目赤肿痛、头痛眩晕、甲状腺肿大、淋巴结结核,高血压等病症的治疗,是一味应用广泛、疗效确切的传统药材[3].夏枯草的产地分布于全国各地,由于不同产地的夏枯草药材物质基础存在一定差异,其疗效也会有所差别,难以进行质量控制.而指纹图谱由于其具有专属性、唯一性、整体性等特点,适合对中药的整体质量评价,其中HPLC指纹图谱应用最为广泛[4].本研究通过对不同产地的夏枯草进行测定和分析,建立不同产地夏枯草药材的HPLC指纹图谱,拟为中药材质量控制提供一种有效的方法.

1 仪器与试药

实验所用的仪器包括:岛津LC2010A液相色谱仪,二极管阵列检测器;Sartorius电子天平(Sartorius公司),KQ-100DE型医用数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);ShimadzuVP-ODS C18柱(150 mm ×4.6 mm,5 μ m).

实验所用试药包括:甲醇为色谱纯,乙醇、醋酸为分析纯,水为超纯水;夏枯草共10批,其来源如表1所示.

表1 夏枯草药材产地与来源

实验数据处理采用图谱相似性评价系统软件(2004A版)及SPSS11.5统计软件.

2 方法与结果

2.1 HPLC指纹图谱色谱条件及药材提取方法的建立

2.1.1 供试品溶液制备.

夏枯草4 g,用60%乙醇回流提取 2 h,获得60%醇提部位溶液;过滤,将滤液于98°水浴锅上浓缩干燥,将干燥物用10 mL 60%乙醇溶解,超声10 min,定容,制备成供试品溶液.

2.1.2 色谱条件.

WondaSil C18色谱柱(250 mm ×4.6 mm,5 μ m),流动相为,甲醇A、B为0.5%冰醋酸,梯度洗脱程序为:0～5 min、A 2%～ 15%,5～ 40 min、A 15%～50%,40～ 50min、A 50%～50%,50～60 min、A 50%～60%,60～ 65 min、A 60%～ 60%,65～ 70 min、A 60%～2%.分析时间70 min,流速1.0 mL/min,波长290 nm,柱温30 ℃,进样量10 μ L.夏枯草的HPLC特征指纹图谱如图1所示.

图1 夏枯草HPLC特征指纹图谱

2.2 方法学及其考察

2.2.1 精密度试验.

取同一夏枯草样品溶液,连续进样5次,计算保留时间和峰面积的 RSD,结果见表2.实验结果表明,保留时间和峰面积的RSD都小于3.0%,表明仪器精密度良好.

2.2.2 稳定性试验.

取同一夏枯草样品溶液,分别于 0、2、4、8、12、24 h进样测定,考察其稳定性.计算保留时间和峰面积的RSD,结果见表2.实验结果表明,保留时间和峰面积的RSD都小于3.0%,表明药物在24 h内稳定.

2.2.3 重复性试验.

精密称定同一批样品,按供试品溶液制备方法分别制备6份供试品溶液,按上述色谱条件测定,计算保留时间和峰面积的RSD,结果见表2.实验结果表明,保留时间和峰面积的RSD都小于3.0%,表明实验重复性良好.

3 不同产地夏枯草指纹图谱分析

3.1 共有峰的确定

通过实验发现,10批不同产地夏枯草样品的色谱指纹图谱虽然有一定差异,但其中有14个色谱峰为夏枯草药材的共有特征峰,计算共有特征峰的相对保留时间和相对峰面积,结果见表3与图2.

表2 精密度、重复性、稳定性考察结果

图2 10批夏枯草药材色谱图

3.2 不同产地夏枯草的指纹图谱相似度评价

对10批夏枯草进行指纹图谱测定,用相关系数、夹角余弦及中药色谱指纹图谱相似度评价软件计算相似度,结果见表4.

4 讨 论

4.1 样品制备方法的优化

本实验考察了用甲醇及30%、60%、95%乙醇提取及水提醇沉等方法筛选样品提取条件.结果表明,60%乙醇提取液色谱峰峰形好,基线稳.因此,本实验选用60%乙醇提取.

4.2 HPLC色谱条件的优化

实验发现,采用PDA检测器所获得的各主要色谱峰紫外吸收光谱在254,290,320 nm波长附近有明显吸收.其中,290 nm检测条件下,色谱峰较多,各峰吸收均匀,基线平稳.因此,确定290 nm为检测波长.

表3 10批药材共有峰的相对保留时间

表4 10批药材的相似度评价

4.3 夏枯草药材指纹图谱分析

夏枯草药材相似度分析结果表明:10批药材中有2批药材与对照指纹图谱的相似度较小,分别为0.133和0.062,对应产地为安徽;其余8批均达到0.850以上,对应产地分别为广元、江苏、河南、浙江,其相似度较好.实验结果表明,各产地夏枯草指纹图谱既有共性也有一定的差异,这可能与药材产地的土壤条件、气候环境与种植方法等因素有关,这有待进一步考察.本研究所建立的方法稳定可靠、精密度高、重现性好,可以有效地用于夏枯草药材的质量控制和鉴定.

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京:中国医药科技出版社,2010.

[2] 王祝举,赵玉英,涂光忠,等.夏枯草化学成分的研究[J].药学学报,1999,34(9):679-681.

[3] 刘国强,孙岩辉.夏枯草的临床研究[J].黑龙江医药,2005,18(64):48-449.

[4] 房德敏.中药指纹图谱技术的研究与应用[J].中草药,2005,36(4):236-237.

Study on Selfheal Medicinal Materials HPLC Fingerprint in the Different Production Region

ZHANGJunxia1,MA Yu1,XIAO He2,JIAO Xiaoke2
(1.School of Medicine and Nursing,Chengdu University,Chengdu 610106,China;2.Sichuan Central Pharmaceutical Co.,Ltd.,Guangyuan 628000,China)

This paper establishs accurate,stable and repeatable quality evaluation method of selfheal medicinal materials to provide a reference for quality control by comparing selfheal HPLC fingerprint from different origins.HPLC and Shimadzu VP-ODS C18 column chromatography were used.A mobile phase was 1%acetic acid.B mobile phase was gradient elution of methanol and detection wavelength was 280 nm;The column temperature was 30℃;Velocity was 1.0 mL/min;Analysis of time was 70 mins.Results showed that thismethod made each component in selfheal medicinal materials separate better.According to the detection results,fourteen common peaks were determined for similarity evaluation.Two batches of 10 batches medicinal material shad small reference fingerprint similarity,respectively 0.133 and 0.062.The remaining 8 batches were above 0.850.It indicated that selfheal fingerprints of different origins had both similarities and certain differences.We conclude that the discussed method has high precision,good repeatablity and reliablity and can be effectively used for the selfheal raw materials quality control and identification.

selfheal;HPLC;fingerprint;quality control

R284.1

A

1004-5422(2013)01-0020-04

2012-11-12.

四川省企业技术创新专项——夏枯草膏质量控制技术研究(2011XM062)资助项目.

张俊侠(1960—),女,副教授,从事中药及天然药物成分与质量研究.