吕小生，陈旭义，汤锋武，蒋显锋，张 赛△

（1．乐亭县医院外四科，河北唐山063600；2．中国人民武装警察部队后勤学院附属医院脑系科，天津300162；3．天津中医药大学，天津300193）

胶质瘤发生于神经外胚层，是脑系肿瘤中治疗效果及预后最差的一种，其发病机制不明。随着肿瘤干细胞（tumor stem cell，TSCs）学说的提出［1］，并逐渐进行了大量的深入研究，GSCs可能会为胶质瘤的临床治疗提供一种新的思路。硒是人体生命中的必需微量元素，近20年来，硒的抗癌作用逐渐成为国内外研究的一个热点，实验表明，硒化合物可通过多种机制发挥抗肿瘤作用［2］。活性氧（reactive oxygen species，ROS）在硒的作用机制中非常重要，且本身亦介导硒化合物诱导肿瘤发生凋亡。本实验选用人脑胶质瘤干细胞作为研究对象，通过给予不同浓度的亚硒酸钠侵染后，通过MTT实验及检测ROS含量，探讨亚硒酸钠对脑胶质瘤干细胞的影响。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 细胞系 CD133磁珠分离的人脑胶质瘤干细胞由武警医学院附属医院脑系科惠赠。

1．1．2 分组 给予不同浓度的亚硒酸钠对细胞进行侵染，分为 3个实验组：0．5μmol／L组，1．5μmol／L组，3．0μmol／L组；并设立空白对照组。

1．1．3 试剂与仪器 主要试剂与试剂 亚硒酸钠、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5二苯基四氮唑溴盐、罗丹明 123、DMEM、小牛血清（武汉博士德公司）、酶标仪（芬兰 Wellscan MK3公司）、荧光检测仪（Fluostar，BMG，Germany）。

1．2 方法

1．2．1 四甲基偶氮唑盐（MTT）检测细胞生长抑制效应 收集对数生长期的胶质瘤干细胞以1×104cells／well转入96孔培养板，每孔200μl培养液，继续培养24 h后弃原培养液，加入含不同浓度（0．5μmol／L、1．5μmol／L、3．0μmol／L）亚硒酸钠的DMEM培养液200μl，对照组加入含等体积溶剂的DMEM培养液，每一浓度设6个复孔。并设空白对照，比色时，空白孔调零，于加亚硒酸钠后24 h检测细胞活力。细胞孵育终止前，每孔加入新配制的 MTT（浓度为 5 g／L）溶液 20μl，培养箱内继续作用4 h后弃上清液，每孔加200μl DMSO，振荡10 min充分溶解结晶，用酶标仪在550 nm处测定吸光度值A，取6孔平均值。细胞抑制率按下列公式计算：抑制率＝（A对照-A测定）／A对照×100%，实验重复3次。

1．2．2 细胞内活性氧的测定 因为H2DCFDA氧化时可产生荧光物质，且荧光强度与ROS的浓度呈线性关系，故本研究采用此方法检测细胞内ROS。胶质瘤干细胞用10%的小牛血清吹打混匀后以4×104cells／well孔接种于96孔板，细胞长至融合状态时换用无血清培养基培养24 h，再分别加入0．5μmol／L、1．5μmol／L、3．0μmol／L亚硒酸钠培养 24 h，Hank′s液 清 洗 后，用 2′，7′-Dichlorodihydro fluorescein diacetate H2DCFDA（50μmol／L）孵育 20 min，以荧光检测仪在激发波长360 nm，吸收波长450 nm下检测荧光强度，实验重复3次。

1．3 统计分析

数据用均数±标准差±s）表示。采用采用 SPSS 11．5统计软件进行单因素方差分析差异显著性，以共同对照 t检验比较组间差异。

2 结果

2．1 亚硒酸钠对人脑胶质瘤干细胞生长的抑制作用

MTT法检测的吸光度值随着亚硒酸钠浓度的增高而逐渐降低，而且从数据上可看出，吸光度与亚硒酸钠的浓度成一定的剂量反应关系，各染硒组的吸光度值与对照组比较均有统计学的差异（P＜0．01，表 1）。

2．2 亚硒酸钠对人脑胶质瘤干细胞内活性氧的影响

将不同浓度的亚硒酸钠侵染人脑胶质瘤干细胞后，经过荧光强度的实验可反应出ROS的水平。各染硒组细胞（对照组、0．5μmol／L组、1．5μmol／L组、3．0μmol／L组）内的荧光强度如下：79．53±3．39、286．42±9．58、126．39±4．17、347．17±7．29，从以上数据可以分析，经过染硒处理后，各实验组细胞内的ROS含量提高，与对照组比较后均有统计学意义（P＜0．05，表 2），虽然 1．5μmol／L组的 ROS含量出现了下降，但是继续提高染硒剂量，ROS出现了大幅度提高。

Tab．1 Effects of sodium selenite on the cell growth inhibition（¯x±s）

3 讨论

上世纪70年代就有学者提出肿瘤是一种干细胞疾病的概念，1997年Dick在急性淋巴细胞白血病患者体内分离出肿瘤干细胞，数量较少，仅占肿瘤细胞总数的5%，但只有这群细胞具有自我更新和增殖分化潜能的干细胞特性［3］，从而获得了肿瘤中存在着肿瘤干细胞的直接证据。脑胶质瘤恶性度大，很多瘤体在手术中不能完全切除，且容易复发，放、化疗效果不甚满意，是神经外科较为难处理的病种之一。继有学者提出肿瘤干细胞学说之后，胶质瘤干细胞的研究逐渐成为一个热点，并已经形成了较为成熟的脑胶质瘤培养方法。

Tab．2 Fluorescence intensity of reactive oxygen species of human brain glioma stem cells treated with sodium selenite±s）

Tab．2 Fluorescence intensity of reactive oxygen species of human brain glioma stem cells treated with sodium selenite±s）

ROS：Reactive oxygen species*P＜0．05 vs control group

Group（μmol／L）Fluorescence intensity of ROS Control 79．53±3．39 Low dose（0．5） 286．42±9．58*Middle dose（1．5） 126．39±4．17*High dose（3．0） 347．17±7．29*

目前国内外关于各种肿瘤相关因子的报道非常多，但由于肿瘤的发生是一种多因素相关的综合疾病，与体内的代谢、离子平衡、膜电位变化等息息相关，因此本实验选取微量元素的抗癌作用作为研究靶点。本研究以人脑胶质瘤干细胞作为研究对象，以具有抑制肿瘤生长的亚硒酸钠作为干扰因素，结合硒元素的抑癌功能，从微量元素治疗肿瘤的方向探讨亚硒酸钠对脑胶质瘤干细胞的影响。

根据相关研究，硒化合物的抑癌机制与ROS关系密切，亚硒酸钠可使70%的肝癌细胞发生凋亡，化学发光法检测有活性氧生成，CAT、SOD可大大降低凋亡的程度，这提示凋亡由活性氧介导。Stewart等［4］用亚硒酸钠作用小鼠角质细胞，检测有82羟基鸟嘌呤生成以及细胞凋亡，因此推测凋亡是活性氧诱导。大量国内外的相关研究提示活性氧在细胞凋亡中可能起到第二信使作用。故本研究所选取的测量指标除了细胞生长抑制试验外，还加入了ROS的检测。

在对胶质瘤干细胞的MTT试验中可以看到，随着亚硒酸钠剂量的增大，细胞生长逐渐受到抑制，并且有一定的剂量反应关系，并且所有实验组细胞的抑制均出现了显著性的变化，提示亚硒酸钠对胶质瘤干细胞存在着明显的抑制作用。ROS是体内存在的一类氧的单电子还原产物，包括超氧阴离子、过氧化氢、羟基和自由基等。在许多诱导剂诱导实验中ROS水平的激增已被证实是引起细胞凋亡的重要途径之一，其变化甚至早于细胞凋亡形态学改变［5］。而大量的研究也发现ROS在肿瘤细胞的信号传导、凋亡、相关酶类的促活等关系密切，在本研究中，随着亚硒酸钠浓度的提高，胶质瘤干细胞内ROS的含量明显增加，各实验组的数据对比对照组均显著性提高，这种增高的趋势在1．5μmol／L组中虽然出现了一定的回落，但是继续增加亚硒酸钠剂量，则ROS又大幅度提高，这可能与试验操作本身有关，但是该实验重复了3次，虽然数据有一定的波动，但是这种在中间浓度的回落表现都会出现，这也提示了亚硒酸钠在对干细胞作用时可能涉及到

一些信号传导分子的影响和反馈，但具体因素还需要深入的实验进行分析。

本实验揭示了亚硒酸钠对胶质瘤干细胞的生长抑制作用和对其细胞内ROS含量的影响，初步探讨了亚硒酸钠对胶质瘤的治疗作用，因本实验仅属初步探讨，在数据的研究中尚需很多实验工作，特别是亚硒酸钠对胶质瘤干细胞的影响是唯一的由硒元素决定的还是硒化合物的共同作用未作出研究，而且在具体的实验步骤中亦未对基因的检测、凋亡的分析等进行研究，所以本课题的基础性值得更深层次的探索，具备较强的可持续性，因此显得较有意义和目的性。

［1］ Reya T，Morrison S J，Clarke M F，et al．Cancer stem cells，cancer，and cancer stem cells［J］．Nature，2001，414（6859）：105-111．

［2］ Zhang W，Yan S，Liu M，et al．beta-Catenin／TCF pathway plays a vital role in selenium induced-growth inhibition and apoptosis in esophageal squamous cell carcinoma（ESCC）cells［J］．Cancer Lett，2010，296（1）：113-122．

［3］ 黄 强．胶质瘤干细胞与神经干细胞研究［J］．实用肿瘤杂志，2004，19（4）：267-269．

［4］ Dick JE．Breast cancer stem cell revealed［J］．Proc Natl A-cad Sci USA，2003，100（7）：3547-3549．

［5］ Lau A T，Wang Y，Chiu JF．Reactive oxygen species：current knowledge and application in cancer research and therapeutic［J］．J cell Biochem，2008，104（2）：657-667．