王镇发 李夏兰 陈培钦

（华侨大学化工学院生物工程系，厦门 361021）

低聚异麦芽糖（isomaltooligosaccharide，IMO），是淀粉糖的一种，主要成分为α－1，6－糖苷键结合的异麦芽糖（IG2）、潘糖（P）、异麦芽三糖（IG3）及四糖（含四糖）以上（Gn）的低聚糖［1］。低聚异麦芽糖具有促进双歧杆菌超强增殖、抗龋齿、消除疲劳、促进钙的吸收、增强机体免疫力、润肠通便等生理功能［2－4］。又因其具有低甜度、低热值、低黏度、保湿性、非发酵性、耐酸热性等特性，所以被广泛应用于各类保健品、饮品、奶制品、糖果和面食等［5］。它是功能性低聚糖中产量最大，应用最广泛，集营养、保健、疗效于一体的被称为21世纪的新型生物糖源。

以玉米淀粉为原料制备低聚异麦芽糖目前已经实现工业化，但是以木薯淀粉为原料制备低聚异麦芽糖的研究较少。木薯淀粉的粗蛋白、脂肪和灰分含量比玉米淀粉少，而支链淀粉比玉米高，水解产物的分支低聚糖含量更高，这些特性对生产分支低聚糖都非常有利［6－8］。我国木薯资源丰富，利用木薯淀粉为原料采用多种酶联合作用制备低聚异麦芽糖，可以大幅度提高木薯淀粉资源的附加值，同时为木薯资源的综合利用开辟一条新的途径。

1　材料与方法

1.1　原料与试剂

木薯淀粉：聚祥（厦门）淀粉有限公司。葡萄糖，麦芽糖，异麦芽糖，麦芽三糖，潘糖，异麦芽三糖：均为色谱纯，美国sigma公司；乙腈：霍尼韦尔中国有限公司；耐高温α－淀粉酶（酶活为68 U／mL，自制稀释）、真菌α－淀粉酶（酶活为306 U／mL）、β－淀粉酶（酶活为13 U／mL）：诺维信中国有限公司；普鲁兰酶（酶活为11 U／mL，自制稀释）：无锡杰能科生物工程有限公司；α－转葡萄糖苷酶（酶活为13 U／mL，自制稀释）：日本天野制药株式会社；其他常规试剂均为国产或进口分析纯。

1.2　试验设备

Agilent1100高效液相色谱仪：美国 Agilent公司；电热恒温振荡水槽DKZ－2型：上海精宏实验设备有限公司；奥立龙CHNO60型pH计：上海华东电器集团有限公司。

1.3　试验方法

1.3.1 木薯淀粉制备低聚异麦芽糖工艺流程

需要说明的是，在木薯淀粉制备低聚异麦芽糖过程中糖化和转苷的温度和pH相同；低聚异麦芽糖的主要成分为异麦芽糖、潘糖和异麦芽三糖［9］，分析对象为这3种糖之和。

1.3.2 响应面法试验设计

单因素试验考虑了液化时间、糖化时间、真菌α－淀粉酶酶量、β－淀粉酶酶量、普鲁兰酶酶量、糖化转苷温度、糖化转苷pH、α－转移葡萄糖苷酶酶量对异麦芽糖、潘糖以及异麦芽三糖之和（简称：IG2＋P＋IG3）的影响。根据单因素试验结果选取真菌α－淀粉酶酶量、β－淀粉酶酶量、普鲁兰酶酶量、糖化转苷温度、糖化转苷pH、α－转移葡萄糖苷酶酶量6个因素和IG2＋P＋IG3作为响应值进行6因素三水平的Box－Behnken响应面设计。采用高效液相色谱法分析异麦芽糖、潘糖以及异麦芽三糖的含量［1］。

1.3.3 响应面法试验数据分析

利用Design Expert 8.0.6软件中的Box－Behnken Design模型，对上述6个因素进行响应面分析，并对所获得的响应面回归模型进行显著性检验。

2　结果与讨论

2.1　单因素试验

液化时间从50到190 min，IG2＋P＋IG3在不断降低，这是因为随着时间的增加淀粉液化的DE值不断增加，而低的DE值有利于生成较多的低聚异麦芽糖和较少的葡萄糖；又当液化时间为40 min时液化后的木薯淀粉液很容易退化，不易进行试验，所以液化时间选为50 min。糖化时间从0～8 h，间隔2 h做一组试验，结果糖化时间为4 h时IG2＋P＋IG3最大且所用时间最短。糖化转苷在pH 4.0～5.4这个范围内，IG2＋P＋IG3随着pH的增大而增加；当pH大于5.4，IG2＋P＋IG3随着pH的增大而减少。糖化转苷温度范围35～60℃，在40℃时IG2＋P＋IG3最大。当β－淀粉酶添加量从0～0.20 mL时，IG2＋P＋IG3随着添加量的增加而迅速增加；当添加量大于0.20 mL时，IG2＋P＋IG3稍微减少一些，当添加量大于0.30 mL时，IG2＋P＋IG3趋向平衡，基本不变。当普鲁兰酶添加量从0～0.20 mL时，IG2＋P＋IG3随着添加量的增加而迅速增加；当添加量大于0.20 mL时，IG2＋P＋IG3随之减少。当 α－淀粉酶添加量从0～0.30 mL时，IG2＋P＋IG3随着添加量的增加而迅速增加；当添加量大于0.30 mL时，IG2＋P＋IG3稍微减少一些，当添加量大于0.40 mL时，IG2＋P＋IG3趋向平衡，基本不变。当α－转移葡萄糖苷酶添加量从0.02～0.10 mL时，IG2＋P＋IG3随着添加量的增加而迅速增加；当添加量大于0.10 mL时，IG2＋P＋IG3随着添加量的增加而减少。

2.2　Box－Behnken试验

根据单因素考察结果选取温度（X1，℃）、pH（X2）、α－淀粉酶酶量（X3，mL）、β－淀粉酶酶量（X4，mL）、普鲁兰酶酶量（X5，mL）和 α－转移葡萄糖苷酶酶量（X6，mL）作为考察因素，采用 Box－Behnken法6因素3水平进行试验，以IG2＋P＋IG3（R，mg／mL）作为响应值。试验安排及试验结果如表1。

表1　响应面试验安排表及结果

利用Design Expert软件，对数据进行多元回归拟合，获得以IG2＋P＋IG3对温度、pH、α－淀粉酶酶量、β－淀粉酶酶量、普鲁兰酶酶量和α－转移葡萄糖苷酶酶量的二次多项回归方程：R＝101.22－5.37X1＋3.05X2＋1.61X3－0.61X4＋2.47X5－6.16X6＋2.70X1X2－2.48X1X3＋0.31X1X4－1.79X1X5－0.55X1X6－2.03X2X3＋2.43X2X4－2.02X2X5＋5.47X2X6＋0.74X3X4＋1.14X3X5－0.018X3X6－0.89X4X5－1.55X4X6＋0.57X5X6－10.17X12－11.50X22－5.33X32－2.95X42－7.09X52－7.21X62

从回归模型方差（表2）可知，试验所选用的二次多项模型 F值为9.033，“Prob＞F”＜0.000 1，具有显著性；失拟项为0.158 0，影响不显著，说明模型不失拟；整个模型R2＝0.907 0，变异系数5.79%，表明方程的因变量与全体自变量之间的回归效果显著，此模型拟合较好。

表2　响应面试验方差分析结果

由表 2方差分析结果可知，X1、X2、X5、X6、X2X6、X12、X22、X32、X52、X62对生成IG2＋P＋IG3有显著或极显著的影响，其他因素影响相对较小；方程的一次项和二次项（P＜0.05）比较显著，因素的交叉项（P＞0.05）相互作用不显著，说明各个具体试验因素对响应值的影响是二次抛物面的关系，而各个因素之间的交互作用在试验中影响不大。

2.3　响应面分析

通过Design－Expert统计分析软件作响应曲面，可以直观地分析温度、pH、α－淀粉酶酶量、β－淀粉酶酶量、普鲁兰酶酶量和α－转移葡萄糖苷酶酶量6个因素之间交互作用对IG2＋P＋IG3的影响，结果见图1～图15所示。

从图1可知，IG2＋P＋IG3量受pH和温度共同影响，随着pH的增大，IG2＋P＋IG3量不断增加，但pH超过5.5，则不利于IG2＋P＋IG3量的增加；随着温度的升高，IG2＋P＋IG3量不断增加，在40℃左右达到最大值，之后随着温度的升高，IG2＋P＋IG3量不断下降；pH 5.50，温度为40℃时，IG2＋P＋IG3量达到最大值。从图2可知，IG2＋P＋IG3量受α－淀粉酶酶量和温度共同影响，当温度为35℃或者55℃时，增加α－淀粉酶酶量对IG2＋P＋IG3量的增加影响不大；当温度为40℃、α－淀粉酶酶量为0.25 mL（76.5 U）时，IG2＋P＋IG3量达到最大。从图3可知，β－淀粉酶酶量与温度相比，温度的改变对IG2＋P＋IG3量的影响更大；当温度为45℃、β－淀粉酶酶量为0.15 mL（1.95 U）时，IG2＋P＋IG3量达到最大。从图4可知，IG2＋P＋IG3量受普鲁兰酶酶量和温度共同影响，当普鲁兰酶酶量为0.25 mL（2.75 U）、温度为45℃时，IG2＋P＋IG3量达到最大。从图5可知，IG2＋P＋IG3量受α－转移葡萄糖苷酶酶量和温度共同影响，当α－转移葡萄糖苷酶酶量为0.10～0.15 mL（1.3～1.95 U）、温度为40～45℃时，IG2＋P＋IG3量达到最大。从图6至图9可知，IG2＋P＋IG3量受α－淀粉酶酶量、β－淀粉酶酶量、普鲁兰酶酶量、α－转移葡萄糖苷酶和温度共同影响，适当的酶量和温度有利于IG2＋P＋IG3量的增加。从图10可知，α－淀粉酶和β－淀粉酶相互作用对IG2＋P＋IG3的影响不大。从图11可知，普鲁兰酶酶量的变化比α－淀粉酶酶量的变化对IG2＋P＋IG3量的影响更大。从图12可知，α－转移葡萄糖苷酶酶量的变化比α－淀粉酶酶量的变化对IG2＋P＋IG3量的影响更大。从图13可知，普鲁兰酶酶量的变化比β－淀粉酶酶量的变化对IG2＋P＋IG3的影响更大。从图14可知，α－转移葡萄糖苷酶酶量的变化比β－淀粉酶酶量的变化对IG2＋P＋IG3量的影响更大。从图15可知，α－转移葡萄糖苷酶和普鲁兰酶共同影响IG2＋P＋IG3的量，α－转移葡萄糖苷酶酶量为0.10～0.15 mL（1.3～1.95 U）、普鲁兰酶酶量为0.25～0.35 mL（2.75～3.85 U）时，更有利于IG2＋P＋IG3量的增加。从上述分析可知pH和温度与酶的相互影响比较大，酶与酶之间的相互影响比较小。

图1　pH和温度对IG2＋P＋IG3的影响

图2　α－淀粉酶和温度对IG2＋P＋IG3的影响

图3　β－淀粉酶和温度对IG2＋P＋IG3的影响

图4　普鲁兰酶和温度对IG2＋P＋IG3的影响

图5　α－转移葡萄糖苷酶和温度对IG2＋P＋IG3的影响

图6　α－淀粉酶和pH对IG2＋P＋IG3的影响

图7　β－淀粉酶和pH对IG2＋P＋IG3的影响

图8　普鲁兰酶和pH对IG2＋P＋IG3的影响

图9　α－转移葡萄糖苷酶和pH对IG2＋P＋IG3的影响

图10　α－淀粉酶和β－淀粉酶对IG2＋P＋IG3的影响

图11　普鲁兰酶和α－淀粉酶对IG2＋P＋IG3的影响

图12　α－转移葡萄糖苷酶和α－淀粉酶对IG2＋P＋IG3的影响

图13　普鲁兰酶和β－淀粉酶对IG2＋P＋IG3的影响

图14　α－转移葡萄糖苷酶和β－淀粉酶对IG2＋P＋IG3的影响

图15　α－转移葡萄糖苷酶和普鲁兰酶对IG2＋P＋IG3的影响

2.4　优化工艺条件验证

通过Design－expert软件建立模型分析，得出以木薯淀粉（30%）为原料制备低聚异麦芽糖的最佳工艺条件：糖化转苷温度为41.9℃，糖化转苷pH 5.45，真菌α－淀粉酶酶量为30.60 U／g（淀粉）、β－淀粉酶酶量为1.04 U／g（淀粉）、普鲁兰酶酶量为1.10 U／g（淀粉）和α－转移葡萄糖苷酶酶量为0.48 U／g（淀粉）。液化条件固定为：耐高温α－淀粉酶酶量为2.27 U／g（淀粉）、液化时间为50 min、液化温度为90℃、液化pH 6.2。该条件下反应24 h，IG2＋P＋IG3的预测值为103.8 mg／mL。采用上述优化工艺进行验证试验，为104.3 mg／mL，与预测值的相对误差0.48%。可见此模型可以较好地预测IG2＋P＋IG3的量。

3　结论

在研究单因素影响IG2＋P＋IG3的基础上，进一步采用Box－Behnken法响应面优化。响应面优化模型显著，失拟项不显著。优化后6个因素糖化转苷温度为41.9℃，糖化转苷pH 5.45，真菌α－淀粉酶酶量为30.60 U／g（淀粉）、β－淀粉酶酶量为1.04 U／g（淀粉）、普鲁兰酶酶量为 1.10 U／g（淀粉）和α－转移葡萄糖苷酶酶量为0.48 U／g（淀粉）。该条件下IG2＋P＋IG3为104.3mg／mL，即异麦芽糖、潘糖以及异麦芽三糖总和为0.417 2 g／g（淀粉），与预测值的相对误差为0.48%。说明该模型具有一定的应用价值。

［1］GB／T 20881—2007低聚异麦芽糖［S］

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