陈书艳，蔡晓阳，吴 奇，史海健

(南京工业大学化学化工学院，江苏南京 210009)

萤火虫荧光素存在于萤火虫的发光细胞中，它对三磷酸腺甙(ATP)十分敏感，可用于ATP含量测定［1］。在临床医疗、生命科学研究以及食品卫生检测和环境监测分析等方面得到了广泛的应用。其衍生物甲基荧光素也具有很好的生物医学造影，报告基因等应用［2，3］。

稳定性同位素及其化合物之间的化学性质和生物性质是相同的，只是具有不同的核物理性质。因此，可以用稳定性同位素作为示踪原子，制成含有稳定性同位素标记化合物，广泛应用于医学、环境科学、生物学、农业科学、分析测试等领域。如在医学上，该技术目前已广泛应用于临床研究、多种疾病的诊断与鉴别、病情判断、治疗效果评价、脏器功能研究和新药开发等方面［4～6］。因此研究氘代的甲基荧光素的合成具有十分重要的意义。

本文在前期研究工作［7］的基础上，以2-氰基-6-甲氧基苯并噻唑(1)为原料，经脱甲基、氘甲基化，再与D-半胱氨酸盐酸盐水合物反应合成了新化合物——氘代甲基萤火虫荧光素(4，Scheme 1)，总收率46%，对映选择性100%。1与D-半胱氨酸盐酸盐水合物反应合成了甲基萤火虫荧光素(5，Scheme 1)，其结构经1H NMR，FT-IR和 MS表征。

该方法具有原料价廉易得，反应条件温和，纯度好及收率较高等优点，为生物检测提供了重要试剂。

Scheme 1

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

X-4型显微熔点仪(温度未校正);Bruker MD 300(或500)MHz型核磁共振仪(DMSO-d6为溶剂，TMS为内标);Nicolet AVATAR-360型红外光谱仪(KBr压片);VG-ZAB-MS型质谱仪(70 eV)。

1按文献［7］方法合成;其余所用试剂均为分析纯，其中二氯甲烷和DMF用前经干燥处水。

1.2 合成

(1)2-氰基-6-羟基-苯并噻唑(2)的合成

在反应瓶中加入BBr31.4 mL(15 mmol)和二氯甲烷`15 mL，搅拌下于-78℃滴加1 0.5 g(2.6 mmol)的二氯甲烷(5 mL)溶液，滴毕，于室温反应15 h(TLC监测)。用饱和NH4Cl溶液淬灭反应，用乙酸乙酯(2×10 mL)萃取，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂后经硅胶柱层析［洗脱剂:A=V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=10∶1］纯化得无色晶体2 0.1 g，收率60%，m.p.212 ℃ ～215 ℃;1H NMR δ:10.5(s，1H)，8.04(d，J=9.0 Hz，1H)，7.17(dd，J=9.0 Hz，2.4 Hz，1H)，7.57(d，J=2.4 Hz，1H);IR ν:3 428，3 216，3 074，2 228，1 600，1 461，1 438，1 239 cm-1。

(2)2-氰基-6-氘代甲氧基苯并噻唑(3)的合成

在反应瓶中加入 2 0.1 g(0.57 mmol)，K2CO30.157 g(1.14 mmol)及 DMF 10 mL，N2保护，搅拌下于 0℃ 加入 CD3I 0.05 mL(0.80 mmol);于60℃反应11 h(TLC监测)。加入饱和亚硫酸钠淬灭反应，用乙酸乙酯(2×5 mL)萃取，合并有机相层，用无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂后经硅胶柱层析(A=1∶10)纯化得白色固体3 103 mg，收率 95%，m.p.121 ℃ ～123 ℃;1H NMR δ:8.13(d，J=9.0 Hz，1H)，7.89(d，J=3.0 Hz，1H)，7.35 ～7.31(m，1H);MSm/z:194{［M+H］+，100%}。

(3)4的合成

在圆底烧瓶中加入3 50 mg(0.26 mmol)和甲醇3 mL，搅拌使其溶解;加入D-半胱氨酸盐酸盐水合物35 mg(0.2 mmol)的甲醇(5 mL)溶液;加入10%K2CO3溶液至 pH 7.5，于室温反应1.5 h(TLC 监测反应)。加水 50 mL，用 1 mol·L-1盐酸调至pH 3，产生沉淀，过滤，滤饼干燥得淡黄色固体4 60 mg，收率80%，m.p.182℃ ～185℃，［α］-42.85°(c0.01，THF);1H NMR δ:13.14(s，1H)，8.04(d，J=5.5 Hz，1H)，7.76(d，J=1.5 Hz，1H)，7.21 ～ 7.19(dd，J=1.5 Hz，1.5 Hz，1H)，5.43 ～5.40(m，1H)，3.80 ～3.76(m，1H)，3.70 ～3.66(d，1H);MSm/z:297{［M+H］+，100%}。

(4)5的合成

在反应瓶中加入1 0.31 g(1.63 mmol)，D-半胱氨酸盐酸水合物0.288 g(1.64 mmol)，甲醇15 mL及水10 mL，搅拌下加入K2CO30.145 g(淡黄色逐渐变浅，有气体放出)，搅拌10 min(TLC监测)。旋蒸除甲醇，残余液用 0.1 mol·L-1NaOH溶液调至pH 8.5，用乙酸乙酯(2×10 mL)萃取，水层用1 mol·L-1盐酸调至 pH 1 ～2，有大量白色固体析出，过滤，滤饼干燥得白色固体5 0.38 g，收率80%，m.p.173 ℃ ～174 ℃，［α］D20-44.8°(c1.2，THF);1H NMR δ:8.04(d，J=8.9 Hz，1H)，7.76(d，J=2.6 Hz，1H)，7.21(dd，J=8.9 Hz，2.6 Hz，1H)，5.42(t，J=9.6 Hz，1H)，3.87(s，3H)，3.66 ～3.80(m，2H);IR ν:3 437，2 972，2 927，1 733，1 586，1 492，1 260，1 215，1 060，1 023，909，868 cm-1。

2 结果与讨论

2.1 合成

在2的合成中，分别采用了吡啶盐酸盐和BBr3作为去甲基试剂。前者反应温度高达190℃，吡啶盐酸和1在熔融状态下反应，收率较高(80%)，但分离困难，纯度低。后者采用BBr3作为去甲基试剂，收率较低(60%)，但反应操作和后处理较为方便，纯度也较高。

3的合成用CD3I与2在碱性条件下进行Williamson反应。实验结果表明，反应温度为60℃时收率较高(95%)。

在4的合成中，采用仿生合成的方法，利用半胱氨酸盐酸盐水合物作为手性底物参与不对称合成，有效的得到手性单一的产物——D-(-)-氘代甲基荧光素，对映选择性高达100%。反应在室温，避光，氮气保护，碱性条件下顺利进行，收率较高(80%)。

2.2 表征

在3的1H NMR分析表明，4-H在8.13处出现一个双峰，7-H在7.89处出现一个双峰，5-H多重峰及7-H双峰的出现应该是彼此的氢远程效应所导致的。与1的1H NMR谱图［1H NMR(DMSO-d6)δ:8.14(d，J=9.1 Hz，1H)，7.86(d，J=2.5 Hz，1H)，7.32(dd，J=2.6 Hz，9.2 Hz，1H)，3.88(s，3H)］相比，3 的1H NMR 谱图中3.88处的CH3O处的甲基氢消失了，氘代比较完全。

在4的1H NMR分析表明，羧酸氢在13.11处呈现多重峰，4-H在8.09处出现一个双峰，5-H在7.19 ～7.21 处出现一个 dd 峰，7-H 在7.76处出现一个双峰，5-H dd峰及7-H双峰的出现应该是彼此的氢远程效应所致。4'-H在5.40～5.46处出现一个多重峰，5'-H分别出现在3.70和3.79处。和5相比，氘代甲基荧光素的1H NMR谱图中3.87处CH3O处的甲基氢消失了，确证了该化合物的结构。

3 结论

设计了一条新的氘代甲基荧光素的全合成路线。经过实验条件考察确定了三溴化硼脱甲基方法，简化了反应操作。并采用Williamson反应在碱性条件下顺利与氘代碘甲烷反应，再经与手性半胱氨酸碱性条件下反应，顺利地完成了氘代甲基萤火虫荧光素的全合成，总收率达到46%，对映选择性达100%。与文献［1］方法相比，该法具有工艺更简单、总产率更高、操作更安全等特点，具有实际应用价值。该新颖氘代化合物对扩展荧光素的生物研究意义重大。

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［4］郭波莉，魏益民，潘家荣.同位素溯源技术在食品安全中的应用［J］.核农学报，2006，20(2):148 -153.

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