丁涛 吕辰 袁芳 沈崇钰 吴斌 费晓庆 陈国松 张 睿 张晓燕 陈磊 袁娟 庾金良 李丽

（1江苏出入境检验检疫局食品实验室，南京210001；2南京工业大学理学院，南京211816；3桂林理工大学化学与生物工程学院，桂林541004）

高效液相色谱-电喷雾串联质谱法直接测定蜂蜜中脯氨酸

丁涛1吕辰2袁芳1沈崇钰1吴斌1费晓庆1陈国松2张 睿1张晓燕1陈磊1袁娟1庾金良2李丽3

（1江苏出入境检验检疫局食品实验室，南京210001；2南京工业大学理学院，南京211816；3桂林理工大学化学与生物工程学院，桂林541004）

建立了高效液相色谱-电喷雾串联质谱法直接测定蜂蜜中脯氨酸的方法。蜂蜜样品用去离子水溶解后，过0.45μm水相微孔滤膜，高效液相色谱-电喷雾串联质谱进行分析检测。以Phenomenex C18（100 mm×4.6mm× 2.6 μm）色谱柱为分析柱，乙腈和0.1%（v/v）甲酸-5 mmol/L乙酸铵水溶液为流动相进行梯度洗脱，在电喷雾正离子多反应监测模式下进行检测，外标法定量。通过加标验证，该方法检测低限可达25 mg/kg，脯氨酸在0.5～10.0 μg/mL浓度范围内线性关系良好，相关系数大于0.99。在25、50和100 mg/kg三个加标水平下，蜂蜜中脯氨酸平均回收率为83.7～109.6%，相对标准偏差（RSD）为2.4～10.9%。该方法样品处理简单、快速，结果准确，灵敏度高，可以作为日常蜂蜜中脯氨酸的检测方法。

脯氨酸；蜂蜜；高效液相色谱-电喷雾串联质谱

蜂蜜中的蛋白质来源于蜜蜂和产蜜植物，主要存在于花粉当中，在花卉蜜和甘露蜜中的含量分别占1.0～1.5%和3%。氨基酸占蛋白质的1%，其中脯氨酸是氨基酸中最主要成分，占50～85%[1]。研究表明，蜂蜜中脯氨酸的含量不仅被作为衡量蜂蜜中游离氨基酸含量的标准，也被作为蜂蜜成熟度和糖掺假的判定标准[2-3]。

目前，美国分析化学家协会（AOAC）[4]、国际蜂蜜委员会（IHC）[5]等许多国际组织都推荐了蜂蜜中脯氨酸检测方法。现有脯氨酸的检测方法主要集中在分光光度法[4-6]和高效液相色谱法[7]。分光光度法前处理需要衍生化，抗干扰能力较弱，难以满足目前分析检测的需要，而高效液相色谱法在定性和定量准确性上大大提高，但由于脯氨酸不具有紫外或荧光特性，仍需要衍生化，检测通量不能大幅提高。高效液相色谱-串联质谱仪结合了液相色谱和串联四极杆质谱灵敏度高、抗干扰能力强及检测效率高等特点，已成为定性和定量分析首选方法。本研究建立了高效液相色谱-电喷雾串联质谱法直接测定蜂蜜中脯氨酸的方法，该方法灵敏度高、前处理简便、快速准确，适合大批量蜂蜜样品中脯氨酸的检测及分析。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂和材料

高效液相色谱仪（Agilent 1200，美国Agilent公司），三重四级杆串联质谱联用仪（API 4000-Q，美国AB公司）；ELGA-Q15高纯水发生器（英国ELGA公司）。

脯氨酸（Proline）标准品（纯度99%，德国Dr. Ehrenstorfer公司）。乙腈、甲酸为色谱纯，购自德国Merck公司。

1.2 标准溶液的配制

称取脯氨酸标准品10 mg于10 ml容量瓶中，用去离子水溶解，配制成1 g/L的标准储备液，密封保存于4℃冰箱中。再准确吸取1 g/L标准储备液1 ml于10 mL容量瓶中，用去离子水定容得100 mg/L的混合标准溶液。使用前用初始流动相将混合标准溶液稀释成系列标准溶液。

1.3 样品前处理

准确称取蜂蜜样品1.0 g于50 ml容量瓶中，加水混合均匀后定容，取适量溶液过0.45 μm的水相滤膜至进样瓶中，供高效液相色谱-串联质谱仪测定。

1.4 色谱条件

色谱柱：Phenomenex C18（100 mm×4.6mm×2.6 μm）；流速：0.25 ml/min；柱温：30℃；进样体积：5 μl；流动相：A，乙腈；B，0.1%（v/v）甲酸-5 mmol/L乙酸铵水溶液；梯度洗脱程序：0～4 min 90-90%B,4～6 min 90-50%B,6～7 min 50%B,7～9 min 50-90%B，9～10min 90-90%B。

1.5 质谱条件

扫描方式：电喷雾正离子模式（ESI+）；检测方式：多反应检测（MRM）；喷雾电压：4500 V；去簇电压：80 V；气帘气：69 KPa；碰撞气：34.5 KPa；去溶剂温度：500℃；雾化气：345 KPa；辅助气：345 KPa；脯氨酸详细质谱检测参数见表1。

表1 脯氨酸质谱信息表

2 实验结果和讨论

2.1 色谱柱和流动相的选择

本实验选择以0.1%甲酸水溶液和乙腈为流动相梯度洗脱考察Agilent Carbohydrate柱 (150 mm×4.6 mm×5 μm)、Phenomenex NH2柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)和HP Amide（25cm×4.6 mm×2.6 μm）三种分析色谱柱，比较脯氨酸分离和保留效果。结果发现，在相同色谱条件下，脯氨酸在Carbohydrate柱和HP Amide柱上的保留和色谱峰形均优于NH2柱，但同时发现Carbohydrate柱和HP Amide柱耐用性相对较差，大批量样品分析后脯氨酸的色谱峰形和保留时间重现性下降，定性和定量准确性下降。因此，我们尝试使用耐用性相对较好的碳十八色谱柱Phenomenex C18（100 mm×4.6mm×2.6 μm）作为分析色谱柱。实验选择乙腈-水、乙腈-5 mmol/ L乙酸铵溶液、乙腈-0.1%（v/v）甲酸-5 mmol/L乙酸铵溶液作为流动相分析比较脯氨酸保留和峰型效果。结果表明，流动相中加入适量乙酸铵能够有助于脯氨酸的色谱保留，但峰型会出现略微拖尾现象。而少量甲酸的加入，脯氨酸保留时间有所提前，但峰形更对称，同时正离子模式下，加入少量的酸有利于目标化合物的离子化，灵敏度可提高10～20%。

2.2 质谱条件的优化

用流动注射方式将目标化合物标准溶液直接注入质谱仪，进行全扫描检测，得到一级质谱图和准分子离子峰[M+H]+，质谱分析中采用最为常用的电喷雾电离源（ESI）对脯氨酸进行去簇电压、碰撞能量、喷雾气流量的优化，分别选取信号强度最强的两个离子碎片作为定性和定量离子（见图1），实际蜂蜜样品加标图谱见图2。

图1 目标物准分子离子的二级碎片离子质谱图

图2 蜂蜜中添加脯氨酸选择离子流色谱图（添加水平25mg/kg）

2.3 方法的线性范围、回收率、精确度

按1.2制备100 mg/L脯氨酸标准储备液，用乙腈-水（10∶90，v/v）稀释标准工作液，依次得到含量为0.5、1、2、5、10 μg/mL的标准溶液，按优化后的仪器条件测定，外标法定量。以脯氨酸特征离子的质量色谱峰面积为纵坐标、含量为横坐标，绘制标准曲线，相关系数（r）大于0.99，表明脯氨酸在0.5～10.0 μg/ml范围内线性关系良好。分别在江苏油菜蜜（1）、河南荆条蜜（2）、新疆葵花蜜（3）、宁夏棉花蜜（4）、吉林椴树蜜（5）、陕西枣花蜜（6）、山东洋槐蜜（7）、内蒙荞麦蜜（8）8种蜂蜜样品中添加25、50和100 mg/kg 3个不同加标水平的脯氨酸，每个水平重复测定5次。回收率和相对标准偏差范围见（表2）。

2.4 蜂蜜中脯氨酸检测方法结果比对

目前国内蜂蜜中脯氨酸检测常用的方法是SN/T 0850-2000《进出口蜂蜜中脯氨酸的测定方法分光光度法》[12]，尽管该标准方法已经作废，但在没有新标准检测方法发布的情况下，很多检测机构依然将该方法作为参考检测方法使用。对所收集的蜂蜜样品分别用上述方法和本研究方法进行比较，每一样品平行测定 5次（n=5），结果见表3。结果表明：本方法所测得结果都比分光光度方法所测数值略低，其原因为蜂蜜中除脯氨酸外还含有多种蛋白质和其他α-氨基酸，其在酸性条件下都会和茚三酮发生反应，导致使用分光光度法测定时结果偏高。且分光光度法前处理略显繁琐，目前已有文献指出该方法存在实验环境温度、茚三酮显色剂保存条

表2 8种不同种类蜂蜜样品中脯氨酸的加标回收率和精密度（n=5）

表3 8种不同种类蜂蜜中脯氨酸的含量(n=5)

件、沸水浴发色时间等等因素的差异均会导致吸光度数值发生变化，如不能严格控制以上测定条件会直接影响结果的重现性和准确性[8-10]。

3 结论

本文建立了高效液相色谱-电喷雾串联质谱直接测定蜂蜜中脯氨酸含量的检测方法。样品经去离子水稀释溶解后直接进样测定，样品基质对目标测定物无干扰，避免了传统分光光度法中复杂的前处理过程。该方法操作简单、快速、灵敏度高，能够满足蜂蜜中脯氨酸的日常分析要求。

[1]Hermonsin I,Chicon,R M,ea al.Food Chem.2003,83(2): 263-268.

[2]Maria P,Daniel W,Armstrong,Chirality,1994,6(4):270-276.

[3]Bogdanov S,Peter M,Mitt.Lebensm.Hyg.2002,93(7/10): 232-254.

[4]AOACOfficial Method 979.20 Proline in Honey.

[5]Harmonised methods of the international honey commission,International HoneyCommission(2009).

[6]Czipa N,BorbelyM,Gyori Z,Acta Alimentaria.2012,41(1):26-32

[7]蜂蜜中脯氨酸的测定-液相色谱法 国家标准计划编号20110434-T-422.

[8]薛静，梁恒，李甜，等.毛细管电泳-电致化学发光法测定人尿中脯氨酸和羟脯氨酸.分析化学,2005,33(6):785-788.

[9]职明星，李秀菊.脯氨酸测定方法的改进.植物生理学通讯，2005,41(3):355-357.

[10]吴金凤，唐丹舟.影响测定蜂蜜中脯氨酸含量的因素.检验检疫科学，1992，3(2):36-38.

Direct determination of proline in honey by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry

DING Tao1，LV Chen2,Yuan Fang1，SHEN Chongyu1，WU Bin1，FEI Xiaoqing1，CHEN Guosong2，ZHANG Rui1，ZHANG Xiaoyan1，Chen Lei1，YUAN Juan1，YU Jinliang2，LI Li3
（1 Laboratory of Food，Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Nanjing 210001，China；2 College of Sciences，Nanjing University of Technology，Nanjing 211816，China；3 Department of Chemistry and Biological Engineering，Guilin University of Technology，Guilin 541004，China）

A liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry（LC-MS/MS）method was developed for the determination of proline in honey.The honey samples were diluted with deionized water.The separation of analyte was carried out on a Phenomenex C18column（100mm×4.6mm，2.6μm）using mobile phases of acetonitrile-5mmol/l ammonium acetate-0.1% （v/v）formic acid solution with gradient elution.The analysis was carried out by multi-reaction monitoring（MRM）mode with electrospray ionization interface（ESI）in positive mode.The calibration curve was good in the range of 0.5～10 μg/ml（r＞0.99）.The detection limit of the method was 25 mg/kg.The average recoveries were between 83.7%to 109.6%at three spiked levels（25,50 and 100 mg/kg）with the relative standard deviations（RSDs）no more than 10.9%.The method is simple,rapid,and suitable to detect the proline in honey with high throughput.

Proline，Honey，LC-MS/MS

项目资助：质检总局项目2011IK218和2011IK209

丁涛，男，高级工程师，E-mail:dingt@jsciq.gov.cn