严蕾，唐建国

复旦大学附属上海市第五人民医院创伤-急救-危重医学中心，上海 200240

假丝酵母(俗称念珠菌)是人体皮肤、黏膜的常见寄生真菌，也是临床上重要的条件致病性真菌。近10年来尽管新的抗真菌药物层出不穷，但医院获得性念珠菌菌血症发病率依然呈上升趋势，侵入性念珠菌病的病死率也居高不下[1,2]。念珠菌入侵机体造成感染的第1步是黏附于皮肤和黏膜等部位或静脉导管、导尿管等植入物。蛋白质组学和基因组学的发展为人们研究念珠菌细胞壁上各种黏附蛋白的功能提供了有利的工具。念珠菌糖基磷脂酰肌醇锚定细胞壁蛋白(glycosylphosphatidylinositol-anchored cell wall protein，GPI-CWP)几乎都有共同的结构特征：氨基端(N端)信号序列、长度多变的丝氨酸/苏氨酸区和羧基端(C端)GPI锚定区[3]。GPI-CWP不仅参与念珠菌细胞壁的合成及重构，还在介导念珠菌黏附至宿主上皮细胞、内皮细胞及细胞外基质方面具有举足轻重的作用[3]。现就重要的念珠菌黏附相关GPI-CWP：凝集素样序列(agglutinin-like sequence，Als)、菌丝壁蛋白 1(hyphal cell wall protein 1，Hwp1)、上皮细胞黏附素(epithelial adhesin，Epa)、聚苯乙烯黏附增强蛋白1(enhanced adherence to polystyrene 1，Eap1)等的致病机制展开综述。

1 Als

Als家族是白色念珠菌的重要毒力因子，不仅参白色念珠菌黏附宿主，深部侵袭，还与生物膜的形成密切相关。als基因家族目前共发现8个成员(als1～7和als9)。最近还发现als5、als1邻近位点重组产生的一种新基因als51，它有与als5类似的5′ 端和与als1类似的3′ 端[4]。als基因家族各成员在白色念珠菌黏附不同组织时表达不一，白色念珠菌黏附至不同的组织受不同Als调节。Green等[5]刮取人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)阳性患者口腔组织进行白色念珠菌als表达分析时发现，als1、als2、als3和als9几乎在所有样本中均有表达，als5、als7的阳性率为83%，而als6仅为50%。Als1、Als3和Als5促进白色念珠菌黏附至包括口腔上皮、阴道上皮及细胞外基质在内的多种宿主组织，而Als6和Als9仅能调节白色念珠菌黏附至少量的宿主细胞，甚至不能促进黏附至上皮细胞[6,7]。因此，als基因的表达具有组织特异性，不同的Als蛋白在白色念珠菌黏附过程中的功能可能相互协同或相互拮抗，使白色念珠菌以适当的水平黏附宿主，既利于其在体内长期定植，又可播散。Als蛋白也并非白色念珠菌所特有，研究发现在热带念珠菌、近平滑念珠菌、吉利蒙念珠菌细胞壁上均有Als蛋白家族成员表达，但对其在非白色念珠菌致病机制中的研究还比较少[8]。

近年来，Als3由于在白色念珠菌致病的多个环节中起作用而受到广泛关注。它不仅调节白色念珠菌黏附至机体上皮细胞、内皮细胞及细胞外基质，还促进白色念珠菌形成生物膜。通过Als3与体内常驻菌如口腔格氏链球菌的单链DNA结合蛋白(single strand DNA-binding protein，Ssb)交互作用，菌丝相的白色念珠菌可与体内链球菌相连接，促进白色念珠菌生物膜形成及在体内稳定定植[9]。在生物膜的屏蔽下，白色念珠菌可逃避机体免疫系统及抗真菌药物的杀伤，引起慢性持续性感染。Als3绑定至宿主细胞表面E-钙黏蛋白和N-钙黏蛋白后，通过诱导上皮细胞内吞作用而促进白色念珠菌入侵宿主上皮[7,10]。Als3还会破坏上皮细胞，并诱导上皮细胞释放粒细胞集 落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)、白细胞介素6(interleukin 6，IL-6)和 IL-1α[10]。此外，白色念珠菌可通过Als3绑定至铁蛋白，利用宿主铁蛋白作为自身铁的来源[7]。但一些学者由于发现白色念珠菌als3基因突变株依然能形成正常菌丝，黏附微血管内皮细胞并引起扩散性念珠菌病，故认为Als3并非念珠菌毒力所必需[11]。我们对这种观点存在质疑。念珠菌黏附宿主不同组织受不同Als蛋白调节，不同Als蛋白在功能上存在重叠。当一种基因突变时，其他基因可能会代偿性表达增加，使念珠菌保持黏附能力。因此，用一种基因突变模型来研究念珠菌毒力方法的可行性还有待进一步探讨。

2 Hwp1

Hwp1是一种主要在白色念珠菌菌丝表面表达的甘露糖蛋白。Hwp1的N端结构域与上皮细胞转谷氨酰胺酶(transglutaminase, TGase)相互作用，使白色念珠菌以共价形式连接至上皮细胞。TGase的底物通常是富含脯氨酸的小蛋白(small proline-rich protein，Spr)，Hwp1通过模拟这些小蛋白的功能而促进念珠菌连接至分化相对成熟的且膜上具有一种Spr3和角蛋白13的上皮细胞，但对分化不成熟的上皮细胞黏附能力较弱[12,13]。

hwp1表达受cAMP信号途径的精密调节。Wolyniak等[14]发现，应用破坏肌动蛋白丝的细胞松弛素A和分隔肌动蛋白单体的拉春库林后，cAMP信号途径均被破坏，hwp1表达减少。相反，应用F肌动蛋白稳定剂会上调cAMP水平，hwp1高表达。因此，肌动蛋白可调控hwp1的表达。动力学实验结果显示，hwp1表达分为2个时相：先是不依赖于肌动蛋白的慢相，随后是依赖于肌动蛋白的快相。白色念珠菌菌丝的形成也经历2个阶段：初始阶段主要是芽管极化和Hwp1及其他菌丝调节蛋白沉积，该过程与hwp1表达的慢相相关；第2阶段主要是芽管延长，与依赖肌动蛋白聚集的快相相关[14]。通过药物干扰F肌动蛋白的稳定性，可抑制念珠菌菌丝生长，降低真菌毒力。

在转录因子Bcl-1的调节下，Hwp1参与体内外白色念珠菌生物膜的形成。bcl-1突变的念珠菌在人体内只能形成小而不稳定的生物膜。但当hwp1过量表达时，可增加bcl-1突变株生物膜的形成并明显提高小鼠舌部念珠菌负荷[15]。Nobile等[16]研究发现，Hwp1与Als1、Als3在生物膜形成中功能互补。在体外，白色念珠菌野生株可形成>100 μ m厚的生物膜，而hwp1突变株和als1/als3双突变株仅形成5～20 μ m厚的生物膜。将这2种突变株混合后培养，又能形成厚度>100 μ m的生物膜。利用白色念珠菌感染导管模型的研究发现，每种突变株单独形成的有缺陷的生物膜中，仅有少量具有黏附功能的念珠菌，且没有明显的细胞外基质。相反，2种突变株混合形成的生物膜中有丰富的酵母细胞、菌丝纤维和细胞外基质[16]。Hwp1、Als1和Als3在体内外协同促进形成具有念珠菌特色的生物膜[16]。此外，Hwp1与白色念珠菌的交配凝集素同源，能参与念珠菌性别分化，有利于念珠菌交配。但在一定条件下，白色念珠菌可能重新安排表面蛋白，节约用于交配的Hwp1可更多地形成生物膜，有利于其长期生存[16]。

3 Epa

光滑念珠菌在引起念珠菌菌血症的常见念珠菌中排第2位，全世界15%～20%的念珠菌血流感染由光滑念珠菌引起[17]。利用Epa蛋白，光滑念珠菌可在体内外紧紧黏附至哺乳动物上皮细胞。大多数epa基因位于亚端粒区，亚端粒区的基因转录沉默抑制其表达。这种转录沉默几乎均依赖于沉默信息调节蛋白2(silent information regulator protein 2，Sir2)、Sir3、Sir4和Ras相关蛋白1(Ras-proximate 1 or Ras-related protein 1，Rap1)的调控，而 Hdf1、Hdf2和Rif1在特定亚端粒区也能抑制转录[18]。所有这些蛋白均参与epa1亚端粒区转录沉默，从而抑制epa1转录[19]。但epa2和epa3基因的转录沉默只依赖Sir2、Sir3、Sir4和 Rif1，不受Hdf1和Hdf2的调节[20]。这是由于在epa3与端粒之间有一个与Hdf1、Hdf2蛋白在功能上有交叉的顺式作用元件沉默子Sil2126，其作用具有位置特异性，只有当它位于距特定端粒31.9 kb处时才会使基因表达沉默[20]。Gallegos-García等[19]发现，将处于静止期的光滑念珠菌在新鲜介质中稀释后，epa1基因转录立刻被激活，使念珠菌黏附能力增强，但该基因转录很快又被抑制。进一步研究发现，基因转录激活是受转录激活因子LP-Ac的诱导。epa1表达抑制受2种不同途径的调节：依赖于Sir蛋白的转录沉默，以及Hdf1、Hdf2通过终止密码子TAA下游300 bp处的顺式作用负调控元件调节的转录抑制[19]。在这些机制的精确调控下，epa1转录增加只局限于停滞期，而在对数期和静止期转录被抑制[19]。

Epa家族共有23种Epa蛋白参与念珠菌的黏附过程。目前研究最为深入的是Epa1、Epa6和Epa7。Epa1在体内外均能发挥促黏附功能，而光滑念珠菌体外黏附也主要依赖于Epa1。Kuhn等[21]发现，巨噬细胞虽可通过菌体表面Epa1识别光滑念珠菌，但不能吞噬它们和释放炎症介质。由此光滑念珠菌可逃避机体天然免疫，长期定植于宿主，可部分解释人体发生光滑念珠菌菌血症后的高病死率。光滑念珠菌Epa6和Epa7也被认为是辅助光滑念珠菌定植的重要毒力因子，Epa6还促进光滑念珠菌形成生物膜[22,23]。在配基方面，Epa1、Epa6和Epa7均可连接至宿主细胞表面末端为半乳糖残基的多糖上。Epa6的配基最广泛，Epa1次之，而Epa7与Epa6的氨基酸虽有92%相似，但由于N端5个氨基酸的差异，Epa7能绑定的末端仅局限于Galβ 1-3Gal(GalNAc)或 Galβ 1-4Glc(GlcNAc)双糖的配基，因此Epa7的宿主组织特异性最强[24]。

4 Eap1

eap1的转录由cAMP依赖的蛋白激酶途径激活，并受转录因子Efg1的精确调控[25]。Eap1不仅具有促进菌体黏附肾上皮细胞和聚苯乙烯的能力，还促进白色念珠菌生物膜的形成[25,26]。与Als3一样，Eap1也是白色念珠菌连接体内格氏链球菌的重要蛋白，使念珠菌广泛定植于人体[27]。Li等[28]用无黏附作用的酿酒酵母研究Eap1不同区域作用时发现，Eap1的 N端参与调节酵母细胞之间相互黏附及促进侵入性生长。C端串联重复区域的丝氨酸/苏氨酸富集区能使N端配体结合区域伸展到细胞外环境，从而介导菌体黏附至聚苯乙烯和宿主上皮细胞[28]。由于N端配体结合区域远离菌体，因此可针对该N端配体结合区域设计抗体与之结合，阻碍白色念珠菌的黏附、定植。然而迄今为止，对宿主细胞表面Eap1的靶受体研究甚少，因此对Eap1的致病机制还有待进一步探索。

5 其他GPI-CWP

白色念珠菌的Ecm33是体外维持念珠菌细胞壁完整性，参与菌丝相转变、黏附的重要蛋白。ecm33突变株会减少凋亡信号分子Bax激活，抑制生物膜形成，降低白色念珠菌对齿龈黏膜组织的破坏性[29]。Ywp1主要出现在酵母相念珠菌表面。白色念珠菌表面缺乏Ywp1时会变得更有黏附性并形成厚厚的生物膜，提示Ywp1具有抗黏附能力，从而促进酵母细胞播散[30]。近期研究认为，Ywp1中含有N-连接聚糖的相对分子质量为11 000的前肽具有抑制黏附作用[30]。iff4过量表达会提高白色念珠菌黏附至口腔上皮细胞的水平，增强其在小鼠念珠菌性阴道炎模型中的毒力。然而，过量表达Iff4的白色念珠菌易被中性粒细胞杀灭，降低在非中性粒细胞减少小鼠中的血流播散[31]。因此，只有表达适当水平的Iff4，才能使念珠菌具有最强的致病性。

6 结语

念珠菌黏附宿主是其致病的第1步，黏附能力大小决定其毒力水平。目前已发现相当数量的念珠菌黏附相关GPI-CWP，但相应的致病机制尚未完全阐明。主要原因可能是各种黏附蛋白功能重叠，使一种基因突变的常用方法往往不能正确反映该蛋白的功能。近年来，根据念珠菌细胞壁上蛋白-蛋白交互作用(protein-protein interaction，PPI)网中位置邻近的蛋白功能相似而相同转录因子调节的基因功能类似的特点，利用细胞网络方法预测念珠菌黏附相关基因，有助于进一步揭示念珠菌的致病机制[32]。此外，利用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增菌种特异性黏附相关目的基因，将有助于临床鉴别感染的念珠菌菌种。针对念珠菌黏附过程设计相应的防治方案无疑也具有重要临床意义，但相应的基础研究和临床试验依旧任重道远。

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