应时，全哲学

复旦大学生命科学学院微生物学与微生物工程系, 上海 200433

皮肤作为人体最大的器官，拥有达1.8 m2的表面积。皮肤的主要功能是作为物理屏障，保护机体免受外来生物或有毒物质的侵害。同时，皮肤也是人体与外界环境接触的场所，因此常驻有各类微生物，包括细菌、真菌、病毒等。通常这些微生物都是无害的，其中部分微生物还能为人类提供一些机体不具有的重要功能。如一些互生的微生物在皮肤表面广泛存在，可保护机体抵抗入侵的病原体；另外，还有一些微生物具有驯化T细胞的作用，使它们能对相似的入侵病原体作出应答[1]。

如果将皮肤看作一个生态系统，那么它就是由各类微生物和皮肤表面的组织细胞及各种分泌物、微环境等共同组成的整体，维持着微生物群落与皮肤表面组织细胞之间的微妙平衡。这种平衡一旦被打破，可能会引起皮肤病或感染[1-3]。这种扰动既可来自内在因素(如皮肤分泌物的组成变化引起某种特定菌群的生长)，也可来自外在因素(如抗生素的使用或护肤品的涂抹)[1]。为进一步理解皮肤的健康、疾病和感染等，需更全面了解皮肤微生物群落的结构特点及其与皮肤组织和环境的相互关系。

1 皮肤的结构和生理特性

皮肤的基本组成从内到外依次为皮下组织、真皮层和表皮层。从结构上看，表皮层作为皮肤的最外层，表面覆盖有疏水角质层，起主要物理屏障作用，既能抵御外来物的入侵，也能阻止水分和营养的流失[4-6]。皮肤表面大多是清爽、干燥、偏酸性的，但来源于真皮层和皮下组织的毛发和分泌管能突破表皮层，使不同部位因为分布的腺体和毛囊密度不同以及本身的厚度和褶皱而呈现皮肤表面环境的差异[7]。

皮肤表面的腺体主要有皮脂腺、大汗腺和小汗腺。皮脂腺主要分布在头皮、脸、颈部和胸，不分布于手掌和脚掌处。皮脂腺一般伴随着毛囊出现，分泌的皮脂是各种脂肪的混合物，能为微生物生长提供丰富的营养物，同时也为皮肤提供疏水保护层，并起润滑作用。因此，皮脂腺分布较密的地方相对厌氧。小汗腺是主要的汗腺，较多分布在腋窝、手掌和脚掌处；而大汗腺能分泌较浓且呈乳白色的分泌物，多分布在腋窝和生殖器周围。汗液的pH值通常为中性或微酸性，这也是影响微生物分布的一个因素。

皮肤表面有些部位是半遮蔽的，如腹股沟、腋窝和指缝，有相对较高的温度和湿度。另一些部位如手臂和腿相对干燥，其表面温度受环境影响较大，比其他部位微生物的含量少[1]。

2 皮肤微生物的研究方法

早期的皮肤微生物研究主要采用传统的分离培养方法来识别和描述微生物群落的组成和多样性。随着研究的深入，人们发现有些微生物因生长条件苛刻而难以分离[8]。因此，传统方法的偏向性和局限性使研究者难以正确、全面阐明皮肤微生物的群落结构和多样性特点。

随着16S/18S rRNA基因序列系统发育分类体系的建立，研究进入了以基因水平鉴别和分析微生物群落的阶段。16S rRNA基因在所有细菌和古生菌中都存在，长约1 600 bp，既包含可用于系统分类的高变区，也包含可用于设计通用引物的保守区[9]，所以16S rRNA基因常被应用于细菌的检测。在真菌检测方面，因18S rRNA基因具有高保守性，故常用18S rRNA与28S rRNA的内转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)[10]。至于病毒，现在还没有一套统一的检测方法，一些研究中使用特定病毒类型的相对保守基因进行分析[11-13]。

在测序技术方面，从第1代的Sanger测序法发展到现在的高通量测序[14,15]，不仅通量得到了提高，同时也减少了测序时间和成本；此外，还全面提升了人们对微生物群落的研究能力。现在使用较多的Roche/454测序平台，一次能得到序列长度达400 bp左右的100万条序列，且通过序列末端加一小段用于区分不同样品的标记(barcode)能实现几百个样品的混合测序[16]。与此相比，Illumina平台的通量更高，但得到的序列长度相对较短。因此，具体高通量测序方法的选择需依据实验者的研究目的和实验设计来决定。

高通量测序从根本上改变了人们对微生物群落的认识，从系统的角度去分析和认识皮肤微生物的群落及其功能，而不只是关注传统的所谓病原微生物与疾病的关系。面对数以万计的序列结果，相应的多个生物信息软件已被开发应用，常见的有MOTHUR[17]、WATERS[18]、RDP[19]和QIIME[20]。这些软件虽各有一些缺陷，但都涵盖了基本分析框架，并引进了许多生态学分析的概念，如α、β 多样性等。

2008年，美国国立卫生研究院(National Institutes of Health，NIH)共同基金提出了建立人类微生物组计划(Human Microbiome Project，HMP)，共同研究人体5个不同部位(皮肤、鼻孔、口腔、肠道和阴道)的微生物群落特点，并分析其与人类健康和疾病的关系。该计划希望通过利用高通量测序技术得到的大量序列分析结果，为未来临床研究微生物与疾病和健康的关系建立一个基准[21-24]。

3 健康人群的皮肤微生物

采用纯培养方法的研究已发现皮肤为许多互生菌提供了适宜的生存场所，同时这些健康人体中的互生菌也为宿主提供了直接或间接保护。直接保护主要包括分泌细菌素和有毒代谢产物、诱发较低的氧化还原电位、竞争营养物质和分解入侵菌产生的有毒物质等[25]。如表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)能表达肽链内切酶，与抗菌肽协同作用，抑制金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的增殖[26]；一些菌株还能分泌细菌素，抑制其他有毒的葡萄球菌[27]。间接保护包括诱导宿主增加抗体分泌、刺激吞噬作用和清除机制的发生、增强干扰素和细胞因子产生等[25]。有研究发现，痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)能分解脂肪，从而形成脂肪酸来酸化环境并抑制化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)的生长[28]。

采用分子方法的研究目前主要是探索不同个体间微生物群落组成的特点(包括一致性和差异性)，较少开展生理和病理意义上的研究。已有研究显示，属放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes) 和变形菌门(Proteobacteria)的微生物是皮肤细菌的主要菌群，其比例甚至高达94%[29,30]。虽然皮肤细菌在门水平呈现较低的多样性，但种属水平的多样性较丰富，且呈现明显的部位差异。根据不同部位的生境特点，许多研究者将其分为干性、油性和湿性3种。其中常见的油性部位有前额、背部和鼻翼等，湿性部位有鼻孔、腋窝和指缝等，干性部位有前臂、手掌和臀部等。通常油性部位多样性最低，干性部位多样性最高。在油性部位占主导的是丙酸杆菌属(Propionibacterium)[31]，这与基于纯培养方法的研究所得结论一致，因为皮脂腺密集的部位较适合一些兼性厌氧和嗜脂微生物的生长[32]。湿性部位最多的是葡萄球菌属和棒状杆菌属(Corynebacterium)[31,33]，对大汗腺部位的研究发现这两类菌与汗液的臭味密切相关[34]。在干性部位存在多个种属的细菌，未见某种细菌占主导地位，其中手掌和前臂的细菌多样性超过肠道和口腔[33]。

一般而言，同一个人左右对称部位细菌群落的差异小于不同人该部位的差异，而后者的差异又小于同一个人不同特征部位之间的差异[31,33]。以往研究表明，部位的生境特点比个体特征更能决定其上的微生物群落分布特征[33,35]。有些不同部位之间的差异很小，如肘窝和膝后窝，恰恰是因为这些部位的生境特点近似[31]。即便如此，同一个人对称部位的细菌群落差异依然较大。有研究显示，同一个体左右前臂共同的种水平分类操作单元(operational taxonomic unit，OTU)数量平均只占28%[29]，甚至同一个体的左右手只有17%的OTU为共同拥有[30]。

除皮肤不同部位的生理特性如湿度、油脂、pH值等会影响菌群的分布外，作为宿主的个体由于年龄、性别、人种和地域等不同也会影响菌群的分布特点，造成人际间的差异[36]。即使是同一个部位，如前臂在不同人之间所共有的OTU数量只占2%[29]。总体来看，油性部位如鼻翼、后背和胸口的人际间差异最小[31]。另外，皮肤本身也会随着人年龄增长而不断变化，自然会改变其上的微生物群落结构[37]。通常子宫内的胎儿皮肤是无菌的，而一旦出生，无论是顺产还是剖宫产，初生儿的皮肤马上会有微生物定居[38]，且在出生的头1年其皮肤微生物的多样性会随着年龄而增加[39]。在青春期，皮脂含量的改变也会影响皮肤嗜脂菌的含量[1]。男女由于生理结构的差异造成皮肤汗腺、皮脂腺及激素分泌的差异，因而在一定程度上也会影响皮肤微生物的分布[30,40]。至于人种的差异，有研究表明，与黑种人相比，白种人鼻上更易驻存金黄色葡萄球菌，同时白种人也更易被链球菌感染[41]。地域不同导致环境气候不同，也会影响皮肤的状况及微生物群落。最近的一项研究发现，委内瑞拉一村庄里的印第安人与美国本土居民在微生物群落结构上存在差异，当然这种不同可能是由多种因素造成的[42]。

人体的外部影响，如职业、衣着、药物和清洁用品也会改变微生物的群落结构[43]。药物如抗生素的使用，可能会抑制一些常见菌种而增加其他菌的数量[44]。同样，清洁用品的使用也会去除一些暂驻菌群，减少常驻菌群的数量[30]，但具体机制与效果还不明确。

显然，健康人体的皮肤微生物并不是一成不变的。比较同一部位微生物群落的变化特点时发现，随时间流逝，群落结构最稳定的部位是外耳道、鼻和腹股沟[31]，这些部位都是半遮蔽的。一般而言，似乎多样性越高的部位群落结构越不稳定，包括前臂、膝后窝、肘窝、脚后掌和指缝[31]。

相对于细菌而言，目前应用于皮肤真核微生物群落分析的分子生物学方法还不够完善。大部分使用分子生物学方法检测到的皮肤真菌主要是马拉色菌属(Malassezia)，与纯培养的结果基本一致[45-47]。另外一些纯培养方法发现的皮肤真菌如德巴利酵母属(Debaryomyces)和隐球菌属(Cryptococcus)，用分子生物学方法却未检测到[1]。有报道称马拉色菌占所有皮肤真菌总数的53%～80%，在耳翼后含量最高[47]。对人体皮肤其他真菌的组成，目前还不清楚，需进一步研究。

针对皮肤微生物群落中的病毒，仍缺乏一套完善的分离及识别方法。目前已发现的常见皮肤病毒有人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)[48-50]。近期通过DNA病毒的高通量测序发现了皮肤病毒的高多样性，并检测到多瘤病毒、乳头瘤病毒和圆环病毒等[51]。病毒也是皮肤微生物生态系统中的重要组成部分，需开发更多的分析手段来进行皮肤上病毒组成的相关研究。

4 皮肤微生物与疾病

从最初临床使用抗菌药物治疗疾病的思路来看，人们总希望找到特定微生物感染与疾病的对应关系。但分子生物学技术能检测到更具多样性的微生物群落，一些原本在伤口处通过纯培养方法得到的特定“致病”菌，如今却发现其并不是伤口处仅有的，如糖尿病并发症足溃疡和下肢静脉性溃疡引起的伤口[52-54]。这些菌虽不是引起伤口的病原体，但促进了炎症和伤口的持久不愈合。在一项小鼠实验中发现，患处的微生物群落结构会随伤口的恶化而发生改变[55]。而烧伤伤口处的情况相反，即依然易检测到引起感染的特定菌，通常是化脓性链球菌、肠球菌(Enterococcus) 或铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)等，也有一些真菌或病毒[56]。这都提示人们需从更加全面的角度来探索疾病与微生物群落的关系。

对于许多疾病，分子生物学方法检测往往能发现患病部位的微生物群落结构发生改变。一项对银屑病的研究发现，与健康人的相同部位相比，患病部位的微生物群落多样性往往更高，且伴随葡萄球菌增加和痤疮丙酸杆菌减少[57]。

另外，对一些人们最初认定的入侵暂驻菌如金黄色葡萄球菌，如今却发现其是人体皮肤的常驻互生菌群[58,59]。同样的还有脂溢性皮炎，研究发现马拉色菌是引起该病的原因，并从机制上得到解释[60,61]；但后来发现在健康人皮肤中也存在大量马拉色菌，并没有引起脂溢性皮炎。还有与青春期痤疮密切相关的痤疮丙酸杆菌也是人体常见的互生菌，它在青春期会随皮脂分泌增多而大量繁殖，并分泌脂肪酶、蛋白酶和透明质酸酶，破坏组织并进入毛囊皮脂腺而引起感染[62,63]。

人们还注意到，一些菌的存在有助于其他潜在致病菌的大量繁殖，引起疾病，这暗示微生物之间相互作用的重要性[3]。如通过绷带将局部皮肤密封，会使一些厌氧或兼性厌氧的潜在致病菌(如金黄色葡萄球菌)过量繁殖，从而引发疾病[64]。还有一项有意思的发现，即一些皮肤的细菌能作用于分泌的汗液从而散发出气味，诱使一种传播疟疾的蚊子叮咬人体[65,66]。对互生菌与潜在致病菌相互作用的了解，也正随着对皮肤微生物研究的深入而加深，但至今仍未在微生物群落层面得到充分解释。

随着研究的深入，人们意识到皮肤微生物群落可能发生转变而成为疾病的一个诱因；但这并不意味着致病菌的获得或皮肤表面污染就会引起疾病，或洗手就能直接预防疾病、使用抗生素就能消除疾病。这些行为引起的病原微生物量的改变都会被个体微生物群落中的常驻微生物稀释、中和而达到平衡。因此从某种意义上说，针对这种群落结构的调整是否能引发宿主的免疫反应才是导致疾病的关键。研究发现，皮肤微生物面对突发的炎症能引发免疫反应，从而起到有效的控制作用，这为两者与疾病的关系提供了印证[67]。在类似的许多疾病如痤疮、特异性皮炎和牛皮癣等中，都发现常驻微生物群落发生变化[57,68,69]。因此，将来的研究要进一步关注常驻微生物群落的变化及其产生的后果，这有助于对疾病和健康的理解。

5 皮肤微生物群落研究的其他应用

皮肤微生物对疾病的产生和抑制可能有一定贡献。因此，一味地使用抗生素在减少有害菌的同时也会减少一些有益菌。人们在使用益生菌治疗某些疾病时发现，益生元能有选择地平衡皮肤微生物群落组成，即在减少有害菌的同时保护一些有益菌[70]。在肠道微生物的研究中发现常见的益生菌(乳酸菌)能有效调整肠道免疫功能[71]。类似地，在给患有特异性皮炎的婴儿服用含益生菌的饮食后发现症状显著改善[72-74]。同时还有研究发现,口服益生菌对健康人可有效帮助皮肤免疫系统免受紫外线的伤害[71]和减少表皮水分流失[75]。益生菌的局部使用较少，但有研究证实丝状透明颤菌(Vitreoscillafiliformis)能改善脂溢性皮炎和特应性湿疹的症状[76,77]。这些为皮肤疾病的治疗提供了新思路，但需要更多研究确认。

皮肤微生物的研究也为清洁产品的开发提供了新的观念：并不是一味减少微生物的含量就会健康，还需考虑维持皮肤微生物群落的平衡，以及保护那些有益的菌群。

还有一个很有趣的应用是在法医学领域的尝试。由于皮肤表面的微生物可通过触摸传递到物体上[78]，且能在环境中保持较长的时间[79]，这为其在法医学领域的应用提供了可能。最近研究发现，皮肤微生物具有较高的个体部位特异性[29-31,33]。另外，皮肤微生物群落在时间上具有一定的稳定性，手掌表面的微生物在洗手后的数小时就能恢复[30]，这种稳定性的平均时间长达数个月[31,33]。有研究尝试通过采集几组键盘和使用者手指上的微生物群落，发现两者具有高度对应性，即使将键盘放置2周后仍具有对应性[80]。当然，将其落实到实际的侦破工作中还需更多的检验。

6 结语

由于人体皮肤微生物群落的研究尚处于起步阶段，相关进展比较缓慢，因此对其生理和病理意义方面的研究并不多。分子生物学方法的应用使人们对皮肤微生物群落有了更全面的认识，但还有很多新的问题有待解决，需更多地从生态学的角度去研究微生物群落与宿主和疾病之间的关系。已有的研究显示，皮肤的微生物群落具有一定的个体差异性，时间上具有一定的结构稳定性，同时也存在作为核心微生物组的常驻微生物群体。提示对微生物群落的多样性需从不同的层次来考察：微生物群落水平、个体水平和人群水平，而不能局限在某种特定的微生物与宿主和疾病的联系。因此，对这些微生物不能简单区分为致病菌或潜在致病菌、无害或有益的互生微生物，其对疾病的产生和抑制都可能有一定贡献，需从更全面的角度来考察具体机制。

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