刘金英，马 薇，张 煦

(1.西北民族大学医学院形态学教研室;2.兰州大学基础医学院病理学研究所;甘肃兰州，730030)

TSLC1(tumor suppressor in lung cancer 1，TSLC1)属肿瘤抑制基因，研究发现，恶性肿瘤中存在TSLC1 基因表达降低或缺失，并且与肿瘤侵袭转移密切相关［1］;并且TSLC1 基因表达缺失多与启动子甲基化状态相关［2］。卵巢癌是女性常见生殖系统肿瘤，较早发生侵袭和转移，严重威胁妇女的健康。本研究旨在探讨TSLC1 基因在卵巢癌细胞系中CPG 位点的甲基化状态及该基因的表达情况，为寻找卵巢癌基因治疗的靶点提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂:DNA 提取试剂盒、PCR 试剂盒和RT-PCR 试剂盒(Promega 公司);McCOY's 5A 培养基(Sigma 公司);Trizol 试剂(Invitrogen 公司);DMEM/HamF12 培养基(Thermo公司);胎牛血清(Hyclone 公司);兔抗人TSLC1 单克隆杭体(Abcam 公司);引物合成(上海生工)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:人卵巢癌细胞系ES-2，SK-OV-3 细胞于McCOY's 5A 培养液(内含10% FBS)，JHOS-3 细胞系于DMEM/F12 培养液(DMEM∶HamF12 =1∶1，含15% FBS)，恒温培养箱中培养(37 ℃，5% CO2)。ES-2，SK-OV3 细胞5 d传代1 次，JHOS-3 细胞9 d传代1 次，以对数生长期细胞为实验细胞。

1.2.2 生物信息学分析:通过NCBI、MethPrimer 进行启动子CpG 位点分析。Primer Premier 5.0 软件设计RT-PCR 引物，MethPrimer 设计MSP 的特异性引物。

1.2.3 DNA 的提取及MSP:DNA 提取依试剂盒说明书。Epitect Bisulfite Kit 对基因组DNA 进行亚硫酸盐修饰与纯化。纯化后的DNA 作为模板，EpiScope@ MSP kit 进行MSP反应。MSP 甲基化引物序列:上游5'-AGTGACGGAAATTTG TAACG-3'，下游:5'-AAAAACTCGAACTCCAAAAAACG-3';MSP 非甲基化引物序列:上游:5'-AGTGATGGAAATTTGTAA TG-3'，下游:5'-AAAAACTCAAACTCCAAAAAACA-3'，产物片段长173 bp。取5 μL PCR 产物3%的琼脂糖凝胶(含溴化乙啶)电泳，Bio-Rad 成像系统采集图像。

1.2.4 RNA 提取及反转录:用Trizol 试剂提取总RNA，按照反转录试剂盒说明合成cDNA。TSLC1 引物序列上游:5'-GGTGATGGGCAGAATCTGTTTAC-3'，下游:5'-ACCAGGACTG TGATGGTGGTGT-3'，产物片段302 bp;β-actin 引物序列:上游:5'-AAATCTGGCACCACACCTT-3'，下游:5-AGCACTGTGTT GGCGTACAG-3'，产物片段500 bp。扩增产物2%的琼脂糖凝胶电泳，采集图像，Quantity one 软件进行分析，以TSLC1/β-actin条带吸光度的比值作为相对表达水平。

1.2.5 Western blot 检测TSLC1 蛋白表达:RIPA 裂解液提取各细胞系总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度。经SDS-PAGE 分离后转移至PVDF 膜上，5%脱脂奶粉封闭，一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育2 h，经BeyoECL Plus 化学发光法显影，采集图像，条带分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 MSP 检测:TSLC1 基因启动子在SK-OV3 和JHOS-3 细胞系中为甲基化的状态，在ES-2 细胞系中为非甲基化的状态(图1)。

2.2 TSLC1 mRNA 在各细胞系中的表达:TSLC1 mRNA 在ES-2 细胞系阳性表达，在SK-OV3 和JHOS-3 细胞系中表达缺失，3 种卵巢癌细胞系中mRNA 表达差异有统计学意义(P＜0.01)(图2A，表1)。

2.3 TSLC1 蛋白在各细胞系中的表达:ES-2 细胞系中TSLC1 蛋白表达，而SK-OV3 和JHOS-3 中的TSLC1 蛋白表达量极低，检测结果同RT-PCR 相符合，TSLC1 蛋白在3 种卵巢癌细胞系中表达差异具有统计学意义(P＜0.01)(图2B，表1)。

图1 ES-2，SK-OV3 和JHOS-3 细胞系中TSLC1基因启动子甲基化状态Fig 1 The methylation of TSLC1 gene promoter in ovarian cancer cell lines

表1 各细胞系中TSLC1 mRNA 及蛋白的相对表达水平Table 1 TSLC1 mRNA and protein relative expression level in ovarian cell lines(±s，n=3)

表1 各细胞系中TSLC1 mRNA 及蛋白的相对表达水平Table 1 TSLC1 mRNA and protein relative expression level in ovarian cell lines(±s，n=3)

*P＜0.01 compared with SK-OV3 and JHOS-3;#P＜0.01 compared with SK-OV3 and JHOS-3;n．s．negative．

cell lineTSLC1 mRNATSCL1 protein ES-20.876 +0.146*0.827 +0.042#SK-OV3n．s．0.034 +0.001 JHOS-3n．s．0.073 +0.001

3 讨论

图2 TSLC1 基因和蛋白在ES-2，SK-OV3，JHOS-3细胞系中的表达Fig 2 The expression of TSLC1 mRNA and protein in ovarian cancer cell lines

抑癌基因的丢失或失活可能导致肿瘤的发生、发展，在抑癌基因失活发生过程中，启动子区CpG 岛甲基化是一个重要机制。文献报道，TSLC1 基因在多种恶性肿瘤中存在CpG岛甲基化，导致基因表达缺失［3］。本研究发现SK-OV3，JHOS-3 细胞系中TSLC1 基因启动子发生甲基化，相应的mRNA 和蛋白表达阴性;在ES-2 细胞系中该基因正常表达。由于SK-OV3 和JHOS-3 细胞系均属于卵巢腺癌，ES-2 细胞系属于透明细胞癌;提示:在不同病理分型的卵巢癌中TSLC1 基因可能发挥不同的作用。对于TSLC1 基因去甲基化后是否再次表达，是否恢复其抑癌作用，从而作为基因治疗的新靶点;而不同组织来源的卵巢癌病变中，TSLC1 在发挥何种功能，对这些问题有待进一步探索和研究。

［1］Liang QL，Chen GQ，Li ZY，et al．Function and histopathology of a cell adhesion molecule TSLC1 in cancer［J］．Cancer Invest，2011，29:107－112．

［2］Chen K，Wang G，Peng L，et al．CADM1/TSLC1 inactivation by promoter hypermethylation is a frequent event in colorectal carcinogenesis and correlates with late stages of the disease［J］．Int J Cancer，2011，128:266－273．

［3］李亮，王俊和，抑癌基因TSLC1 及其甲基化［J］．华西医学，2010，1:241－243．