罗 宏，苏吉儿，韩 松，李俊发

(首都医科大学神经生物学系北京脑重大疾病研究院，北京100069)

国内外研究数据显示，血管相关性疾病位于国民死亡原因之首，其中脑卒中作为一种高致死、高致残性疾病，给各国家庭和社会带来了巨大的经济损失和精神负担［1－2］。然而，目前临床对脑卒中的治疗尚缺乏有效的治疗措施［3－4］。缺血/低氧预适应(I/HPC)可提高组织器官对继发严重缺血/低氧损伤的耐受，对这一内源保护机制的研究，可为脑卒中临床治疗打开新视野［5］。近年研究表明，HPC 形成的众多可能机制均涉及蛋白激酶C (PKC)的参与，且本实验室前期研究发现，经典型PKC Ⅱ(cPKCⅡ)、γ (cPKCγ)和新奇型PKCε(nPKCε)的膜转位(激活)水平增高参与了小鼠脑HPC 形成的同时，cPKCγ 及其相互作用蛋白在HPC 保护缺血脑组织中发挥着重要作用［6－8］。据此，本实验拟利用小鼠成神经瘤细胞(N2a)的单纯低氧和氧糖剥夺(OGD)模型，来模拟脑HPC 和缺血损伤，从离体水平上进一步证实cPKCγ 在HPC 对抗N2a 细胞OGD 损伤中作用并探讨其可能的细胞分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

兔源性LC3(Ⅰ、Ⅱ)抗体、鼠源性β-actin 抗体、蛋白酶抑制剂(亮肽酶素、抑肽酶、胃酶抑素A 及糜蛋白酶抑制素)、磷酸酶抑制剂(KF、冈田酸、焦磷酸钠、原矾酸钠)、脂氧胆酸钠、DTT、NP-40、EDTA、EGTA、MTT、DMSO 和cPKCγ 抑制剂Go6983(Sigma-Aldrich 公司);辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔/鼠二抗(中山金桥生物技术有限公司);ECL 发光试剂盒(威格拉斯生物技术有限公司);BCA 蛋白定量试剂盒(Pierce 公司);凋亡试剂盒、CytoTox 96® 非放射性细胞毒性检测试剂盒(Promega 公司);Bio-MaxMR X-线胶片(Kodak 公司)。

1.2 N2a 细胞HPC 和OGD 模型制备

小鼠N2a 成神经瘤细胞(北京大学医学部王韵教授实验室惠赠)，常规培养于含有10%胎牛血清的DMEM(含高葡萄糖)(Gibco 公司)完全培养基中，并置入37 ℃、含21% O25% CO274% N2常氧混合气体、饱和湿度培养箱内培养，24 h换液，2 ～3 d传代。

细胞HPC 模型:将N2a 细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM(含高葡萄糖)培养基中，置于37 ℃、1% O25% CO294% N2低氧气体、饱和湿度下培养。为确定HPC 发挥保护作用的最适低氧时间，通过预实验10、15、20 和25 min 4 个低氧暴露时间点，最后确定HPC 20 min为最适条件。

细胞OGD 模型:细胞培养于无血清的DMEM(无葡萄糖)培养基中，置于37 ℃、1% O25% CO294% N2低氧混合气体、饱和湿度，根据实验需要，培养2、3 或4 h，然后复糖复氧24 h。

cPKCγ 抑制剂Go6983 在细胞进行HPC 前即刻加入，并在细胞培养基中保持终浓度为6 nmol/L。在观察HPC 对OGD 细胞的保护作用实验中，N2a细胞先经过HPC(20 min)预处理后复氧6 h，再进行OGD 3 h处理。

1.3 MTT 比色法

将细胞接种于96 孔板，经不同处理后加入3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)(Applichem 公司)并避光37 ℃放置4 h，MTT 可被线粒体内脱氢酶还原生成结晶状深紫色产物甲臜(formazan)，用DMSO 将其完全溶解后，通过酶标仪测定490 nm波长的吸光度(A490)，来计算细胞生存率。

1.4 乳酸脱氢酶(LDH)漏出率

在96 孔板接种细胞，按照CytoTox 96® 非放射性细胞毒性检测试剂盒规定步骤(Promega 公司)，定量测量(A490)细胞LDH 漏出率，来确定细胞坏死水平。

1.5 原位末端标记(TUNEL)染色

细胞爬片、经各组不同处理后，首先按Promega原位末端标记(TUNEL)试剂盒步骤染凋亡细胞，然后用Hochest 33258 复染细胞核、封片、荧光显微镜下观察细胞凋亡情况。

1.6 蛋白印迹(Western blot)检测

蛋白样品制备、SDS-PAGE 和Western blot 参照文献［6，8］。提取全细胞蛋白、BCA 法定量，－80 ℃保存备用。每组样品取50 μg蛋白进行电泳(10% SDS-PAGE，4 ℃，20 ～30 mA)和转膜(NC膜，400 mA，3 h)。先后用兔源性抗LC3(Ⅰ、Ⅱ，1∶1 000)和鼠源性β-actin(1∶1 000)一抗，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔/鼠二抗(1∶4 000)进行免疫杂交;然后用ECL 发光，X-线胶片曝光、显影、定影。所得结果用Gel Doc 凝胶成像系统扫描后，对目的蛋白进行定量分析。

1.7 统计学分析

TUNEL 染色结果用Image Pro Plus 6.0 图像软件、Western blot 结果用Quantity One 软件进行定量分析。实验数据以均数± 标准差(±s)表示，用SPSS 13.0 统计软件进行单因素方差分析(One way ANOVA)，组间比较采用Bonfferoni 检验。

2 结果

2.1 cPKCγ 和HPC 对OGD 致N2a 细胞损伤的影响

将N2a 细胞进行2 或4 h氧糖剥夺(OGD)，然后复糖复氧24 h。MTT 结果表明(图1A)，OGD 2和4 h可使N2a 细胞的生存率分别降至(79.0 ±2.1)%和(36.9 ±2.0)%;LDH 漏出率结果显示(图1B)，OGD 2 和4 h组的细胞死亡率明显增高(P＜0.05，n=6)。为了便于观察cPKCγ 抑制剂Go6983和低氧预适应(HPC)对OGD 致N2a 细胞凋亡、自噬和坏死的影响，如下实验均采用OGD 3 h、复糖复氧24 h作为模拟细胞缺血损伤的刺激。

图2 细胞生存率结果表明，HPC(20 min)可明显改善OGD 3 h对N2a 细胞的损伤作用(P＜0.05，每组n =16)，而cPKCγ 抑制剂Go6983(6 nmol/L)则明显解除HPC 对OGD 细胞的保护作用(P＜0.05，每组n=16)。

2.2 cPKCγ 和HPC 对OGD 致N2a 细胞凋亡的影响

图3 细胞TUNEL 染色结果示，OGD 3 h可明显增加N2a 细胞的凋亡数目(P＜0.05，n=6)，但单纯HPC(20 min)和cPKCγ 抑制剂Go6983 +HPC 均不能明显地影响OGD 3 h 的细胞凋亡水平。提示cPKCγ 激活、HPC 对OGD 3 h细胞的保护作用均与细胞凋亡无关。

图2 cPKCγ 和HPC 对OGD 致N2a 细胞损伤的影响Fig 2 Effects of cPKCγ and HPC on OGD-induced injury of N2a cells(±s，%，n=16)

2.3 cPKCγ 和HPC 对OGD 致N2a 细胞自噬的影响

利用Western blot 检测LC3 Ⅱ与LC3 I 的比例(LC3 Ⅱ/Ⅰ)，来反映N2a 细胞的自噬水平。图4可见，与常氧对照组(control)相比，OGD 3 h可明显提高N2a 细胞的自噬水平(P＜0.01，n =6);与OGD 3 h组相比，抑制cPKCγ 激活(Go6983)和HPC+Go6983 均可明显降低OGD 3 h细胞的自噬水平(P＜0.05，n =6)，而单纯HPC(20 min)虽使OGD 3 h细胞的自噬水平有所降低，但无统计学意义。提示cPKCγ 激活参与了OGD 3 h致N2a 细胞的自噬改变，而HPC 对OGD 3 h细胞的保护作用可能与自噬变化无关，但为什么HPC +Go6983 降低OGD 3 h细胞的自噬水平要比单纯cPKCγ 抑制的作用更显著，尚有待于进一步的实验分析。

图3 cPKCγ 和HPC 对OGD 致N2a 细胞凋亡的影响Fig 3 Effects of cPKCγ and HPC on OGD-induced cell apoptosis of N2a cells(±s，n=6)

图4 cPKCγ 和HPC 对OGD 致N2a 细胞自噬的影响Fig 4 Effects of cPKCγ and HPC on OGD-induced cell autophagy of N2a cells(±s，n=6)

2.4 cPKCγ 和HPC 对OGD 致N2a 细胞坏死的影响

应用乳酸脱氢酶(LDH)漏出率，来检测N2a 细胞的坏死水平。图5 结果表明，HPC(20 min)明显改善OGD 3 h致N2a 细胞坏死的程度(P＜0.05，n=16)，而cPKCγ 抑制剂Go6983 则解除了HPC 的这种保护作用(P＜0.05，n = 16)。提示HPC 对OGD 3 h细胞的保护作用主要是通过cPKCγ 激活，来减轻N2a 细胞的坏死水平。

3 讨论

缺血/低氧预适应(I/HPC)是指组织器官接受亚致死性缺血/低氧预处理后，可对继发发严重缺血/低氧性损伤产生耐受［5－6］。利用这一内源性保护机制，人们在在体低氧/缺血损伤、离体海马神经元损伤和HPC 预处理干细胞移植等模型上均证实了HPC 对继发神经损伤有明显的保护作用［9－11］。本实验室应用整体小鼠HPC 和大脑中动脉阻塞(MCAO)致脑缺血性卒中模型，也发现HPC 可显著降低缺血脑组织的梗死体积、水肿率、梗死周围区细胞丢失和细胞凋亡数目，改善缺血性卒中小鼠的神经行为学评分，同时证实这些改变与cPKCγ 激活有关［8］。在此基础上，本实验在离体细胞水平上进一步证实了cPKCγ 在HPC 改善N2a 细胞OGD 损伤中具有重要作用。

图5 cPKCγ 和HPC 对OGD 致N2a 细胞坏死的影响Fig 5 Effects of cPKCγ and HPC on OGD-induced cell necrosis of N2a cells(±s，%，n=16)

本实验参考以往文献报道［9，11－12］，根据不同OGD 时间对N2a 小鼠成神经瘤细胞生存率的影响程度，以及不同HPC 时间对OGD 细胞的保护作用，建立了OGD(OGD 3 h后复糖复氧24 h)和HPC(单纯低氧暴露20 min、复氧6 h)的N2a 模型，来分别模拟在体脑缺血/低氧性损伤和低氧预适应刺激。离体OGD 和HPC 细胞模型的成功建立，为深入研究脑缺血/低氧性损伤和适应机制打下了良好基础。

缺血/低氧性损伤途径主要包括坏死、凋亡和自噬等［12－14］，那么cPKCγ 是通过何种损伤途径参与了HPC 对OGD 细胞的保护作用。本实验通过观察cPKCγ 和HPC 对OGD 致N2a 细胞凋亡、自噬和坏死的影响发现，OGD 可引起N2a 细胞发生显著的凋亡、自噬和坏死改变，而cPKCγ 则主要是通过降低细胞坏死来发挥HPC 对OGD 细胞的保护作用，与本实验室在整体MCAO 致脑缺血性卒中模型小鼠上观察到的部分实验结果存在差异，即cPKCγ 激活介导了HPC 缓解脑梗死周围区细胞凋亡的作用［8］。其原因可能与本实验所用N2a 细胞为神经瘤细胞有关，即肿瘤细胞凋亡途径可能与正常细胞存在差异［15］。因此，本实验结果还有待于在其他细胞系和原代培养神经元上证实和检验。

总之，本实验在离体细胞水平上进一步证实了cPKCγ 在HPC 改善N2a 细胞OGD 损伤中的重要作用，且这种作用主要是通过减轻OGD 细胞的坏死水平来实现N2a 细胞对OGD 损伤的耐受。但关于cPKCγ 究竟是通过介导何种信号传导通路来参与HPC 的神经保护作用，还有待于进一步研究。

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