秦娟娟，路志勇，焦章平，朱晓君，王颖希，唐晖

（1.山西医科大学基础医学院法医学系，山西太原 030001；2.北京市公安局刑侦总队，北京 100192）

改良TRIzol法同步提取血液RNA和DNA

秦娟娟1，路志勇2，焦章平2，朱晓君2，王颖希1，唐晖2

（1.山西医科大学基础医学院法医学系，山西太原 030001；2.北京市公安局刑侦总队，北京 100192）

目的建立一种应用TRIzol试剂针对同一生物检材在提取总RNA的同时又能提取DNA的新方法。方法使用传统TRIzol法将含有总RNA的水相移除，调节中间层和有机相的pH值，乙醇沉淀DNA，运用DNA IQTMsystem试剂盒纯化DNA。检测DNA纯度和质量浓度，并以之为模板进行PCR-STR分型。与传统TRIzol法提取的基因组DNA进行比较。结果改良TRIzol法提取的基因组DNA较传统TRIzol法提取的基因组DNA纯度和质量浓度高，扩增后STR分型良好。结论改良TRIzol法可靠易行，能够实现同一样本同时提取RNA和DNA的目的，可以满足法庭科学个体识别和亲缘鉴定的要求。

法医遗传学；提取法；TRIzol法；血液

TRIzol试剂是当前从细胞或组织中提取总RNA的常用试剂，最大的特点就是可同时分离一个样品中的RNA、DNA和蛋白质。使用TRIzol法同时提取法医检材中的RNA和DNA进行个体识别和体液鉴别，已经成为目前法医学实验室研究的热点之一。但是，在提取总RNA之后，仅依照TRIzol试剂盒说明书的操作步骤，利用剩余的中间层和有机相提取DNA，操作时间长（约为3h），且其中的苯酚、蛋白质污染会影响后续实验的效果，不利于该法的推广。本研究对TRIzol法加以改进，使之在同一检材中提取总RNA的同时又能制备较高纯度和质量浓度基因组DNA，且经该法处理后的样本可以用现有常规实验室方法进行后续实验，同时进行手工与自动化提取。

1 材料与方法

1.1 样本

收集健康成人血液200μL，分别取10μL涂抹于20个FTA卡上阴干后，室温储存。10份用于传统TRIzol法，10份用于改良TRIzol法。

1.2 仪器与试剂

小型台式离心机、大型冷冻离心机、NanoDrop® ND-1000微量紫外可见分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific公司），7500实时荧光定量PCR系统、9700型扩增仪、3130XL遗传分析仪（美国AB公司）。

TRIzol®试剂盒、SuperScriptTMⅢRT/Platinum® Taq DNA Polymerase MIX试剂盒（美国Invitrogen生命技术公司），DNA IQTMsystem（美国Promega公司），IdentifilerTM试剂盒（美国AB公司），枸橼酸钠，无水乙醇，氯仿，氢氧化钠（NaOH）。

1.3 方法

1.3.1 RNA和DNA的提取

RNA和DNA的提取分别采用传统TRIzol法和改良TRIzol法进行。

传统TRIzol法：剪取1cm2FTA血卡放入1.5mL的微量离心管中，加入1mL TRIzol，振荡5min，然后加入200μL氯仿剧烈振荡15s，放置3min后，4℃下12000×g离心15min，吸取上层水相液体按照TRIzol说明书的操作步骤提取RNA。在去除上层水相后的中间层和有机相中加入300 μL冷无水乙醇混匀，室温放置3min，4℃下，2000×g离心5min，沉淀DNA。然后用0.1 mol/L枸橼酸钠溶液（含10%乙醇）1 mL洗涤DNA沉淀，室温放置30 min，重复3次，最后用1.5mL 75%乙醇溶液洗涤，室温放置20min，重复3次，空气中干燥DNA沉淀约15 min，用8 mmol/L NaOH溶液40μL溶解DNA沉淀，用10μL TE调节DNA沉淀至pH约为8.4，4℃下保存备检。

改良TRIzol法：RNA的提取同传统TRIzol法。在去除水相后的中间层和有机相中加入5 mol/L的NaOH 10μL立即混匀，室温放置3min后加入300μL冷无水乙醇混匀，室温放置3min，室温下，12 000×g，离心5min，沉淀DNA，加入200 μL裂解缓冲液后采用DNA IQTMsystem试剂盒进行纯化。

分别取以上方法提取的DNA 1 μL，使用Nano-Drop®ND-1000微量紫外可见分光光度计测定DNA 的D260和D280，根据D260与D280的比值确定提取DNA的纯度。

每份样本的纯度和质量浓度均重复测量3次，取平均值。用SPSS 13.0统计软件对两种方法提取的DNA纯度和质量浓度分别进行比较。

1.3.2 扩增和检测

以上提取的RNA按照SuperScriptTMⅢRT/Platinum®Taq DNA Polymerase MIX试剂盒说明，使用文献[1]中的引物序列扩增管家基因18S、GAPDH （TAMRA荧光标记）和外周血特异性遗传标记SPTB （FAM荧光标记）。

提取的DNA均用IdentifilerTM试剂盒进行扩增，3130XL遗传分析仪检测。GeneMapper ID v3.2软件对数据结果进行分析。

2 结果

两种方法提取的DNA纯度和质量浓度，差异均有统计学意义（表1，P＜0.05）。传统TRIzol法与改良TRIzol法提取DNA的STR分型图谱分别见图1～2。采用以上方法提取的RNA，经管家基因18S、GAPDH和外周血特异性遗传标记SPTB检测，均成功得到相应的目的产物。

表1 两种方法提取DNA的纯度和质量浓度比较（n=10，±s）

表1 两种方法提取DNA的纯度和质量浓度比较（n=10，±s）

方法D260/D280质量浓度/（ng/μL）传统TRIzol1.301±0.0650.618±0.209改良TRIzol1.470±0.0651.498±0.297

图1 传统TRIzol法提取DNA的STR分型

图2 改良TRIzol法提取DNA的STR分型

3 讨论

DNA在法医学个体识别和亲子鉴定中发挥着重要作用，但DNA只具有种属特异性而没有组织特异性，不能判断法医检材的组织来源，而mRNA和microRNA具有组织特异性[2]，成为目前法医学体液鉴别的热点。TRIzol试剂内含苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放核酸酶，并且能够同时分离样品的RNA和DNA。然而，目前常用的TRIzol法只对总RNA的分离效果较好，提取的DNA纯度和质量浓度并不理想。本研究采用了一种便捷、高效的改良TRIzol法提取基因组DNA，充分利用实验材料，尽可能多地保留检材中的遗传信息，从而可以满足利用少量生物检材同时确定检材类型和STR分型，具有实际应用价值。

TRIzol法提取RNA和DNA的原理是利用RNA 和DNA的等电点不同，RNA为2～2.5，DNA为4～4.5，因此RNA和DNA的溶解度受pH值的调节。在酸性酚中抽提时，水相回收RNA，然后用乙醇对处于酚相和酚相-水相界面的DNA进行沉淀，再用8 mmol/L NaOH进行溶解。根据碱性环境中DNA水溶性高的特点，改良TRIzol法提前将分离水相后的剩余溶液pH值调至碱性，以促进DNA在含乙醇的有机溶剂中充分沉淀。由于DNA在pH值为5～9的环境中稳定，在pH＞7.8的有机溶液中处于析出状态，当pH＞12会引起双链之间的氢键断裂，因此剩余溶液pH值不宜过高。本法在剩余液中加入5 mol/L的NaOH 10 μL调节其pH≈8，使剩余液的酸碱度达到最佳沉淀条件。此外，Na+的加入也会促进DNA的沉淀，而钠盐在后续的步骤中洗脱。

DNA IQTM法是目前法医学实验室最广泛使用的DNA提取方法，与其他提取方法比较，提取的DNA纯度较好且得率最高[3]。改良TRIzol法将DNA IQTM法和传统TRIzol法相结合，所提取DNA的纯度和质量浓度均高于传统TRIzol法。NaOH溶液的加入使提取的DNA易溶于TE缓冲液或洗脱缓冲液中，可以在-20℃长期保存，免去了传统TRIzol法使用8mmol/L NaOH溶解后又要加入TE缓冲液或HEPES缓冲液调节pH值至8.4才可进行PCR，或调节pH值至7～8并加入1mmol/L EDTA溶液才可以长期保存的繁琐步骤。

在法庭科学中，提取人类基因组DNA的主要目的是用于STR遗传标记的分型检测，达到个体识别或亲子鉴定的目的，而通过对现场检材RNA的分析来进行组织来源的判定，对案件的性质判定具有重要的价值，能够使法医物证检材在法庭中更具有说服力。近年来，Bowden等[4]使用DNA IQTMsystem和Mini RNA Isolation KitTMⅡ两个试剂盒相结合的方法从同一份样本中成功分离RNA和DNA，为法医学实验室通过应用少量检材来同时确定检材类型和STR分型的广泛应用提供了基础。改良TRIzol法作为一种可以同时满足手工与自动化提取同一检材中总RNA和DNA的新方法，可以得到良好的RNA和DNA的STR分型结果，并且能大大缩短操作时间。

本研究所建立的方法操作简便、快速有效，且与现有常用DNA提取平台有机结合，较传统TRIzol法更适用于实际案件检验，为法医学实验室充分利用少量检材来同时确定检材类型和STR分型提供了一种可靠易行的实验方法。

[1]Haas C，Klesser B，Maake C，et al.mRNA profiling for body fluid identification by reverse transcription endpoint PCR and realtime PCR[J].Forensic Sci Int Genet，2009，3（2）：80-88.

[2]Bauer M.RNA in forensic science[J].Forensic Sci Int Genet，2007，1（1）：69-74.

[3]畅晶晶，张素华，李莉.全血中DNA 6种提取方法的比较[J].法医学杂志，2009，25（2）：109-111，114.

[4]Bowden A，Fleming R，Harbison S.A method for DNA and RNA co-extraction for use on forensic samples using the Promega DNA IQTMsystem[J].Forensic Sci Int Genet，2011，5（1）：64-68.

Modified TRIzol Method for RNA and DNA Co-extraction from Blood

QIN Juan-juan1,LU Zhi-yong2,JIAO Zhang-ping2,ZHU Xiao-jun2,WANG Ying-xi1,TANG Hui2
（1.Department of Forensic Medicine,School of Basic Medicine,Shanxi Medical University,Taiyuan 030001, China;2.Criminal Investigation Team,Beijing Public Security Bureau,Beijing 100192,China）

ObjectiveTo establish a new method for RNA and DNA co-extraction from the same sample by TRIzol reagent.MethodsAfter the aqueous phase which contained total RNA was removed by traditional TRIzol method,the values of pH of the interphase phase and organic phase were adjusted. The DNA was precipitated with ethanol and purified with DNA IQTMsystem.The purified DNA was measured in quality and quantity.As the template,it was amplified and typed by PCR-STR.The data was compared with that extracted by traditional TRIzol method.ResultsThe DNA extracted by this modified method showed a better result of quality and quantity than that by traditional TRIzol method and a good STR typing.ConclusionThe modified TRIzol method is advisable and reliable to simultaneously extract both DNA and RNA from the same sample.It could be used for individual identification and paternity testing to satisfy the need of forensic science.

forensic genetics;extraction;TRIzol method;blood

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2013.03.014

1004-5619（2013）03-0209-03

2012-07-13）

（本文编辑：李成涛）

北京市科技计划资助项目（Z111100056811024）

秦娟娟（1987—），女，山西临汾人，硕士研究生，主要从事法医DNA研究；E-mail：594570279@qq.com

唐晖，女，主任法医师，主要从事法医DNA检验和研究；E-mail：huihuitangno1@163.com