罗良鸣，吴玉锋，倪维成，朱华

（1.温州医学院法医学系，浙江温州 325035；2.温州市公安局刑事科学技术研究所，浙江温州 325000；3.诸暨市公安局刑侦大队，浙江诸暨 311800；4.平阳县公安局刑事技术室，浙江平阳 325400）

吗啡戒断大鼠中脑腹侧背盖区GAP－43的表达变化

罗良鸣1，2，吴玉锋3，倪维成4，朱华1

（1.温州医学院法医学系，浙江温州 325035；2.温州市公安局刑事科学技术研究所，浙江温州 325000；3.诸暨市公安局刑侦大队，浙江诸暨 311800；4.平阳县公安局刑事技术室，浙江平阳 325400）

目的观察吗啡戒断大鼠中脑腹侧背盖区生长相关蛋白-43（growth associated protein-43，GAP-43）在不同时程中的表达，探讨GAP-43在吗啡戒断记忆中的作用。方法采用腹腔递增注射盐酸吗啡并自然戒断的方法建立吗啡依赖1周、2周和4周戒断模型，运用免疫组织化学染色观察中脑腹侧背盖区GAP-43的蛋白表达，并用Image-Pro Plus 5.1图像分析软件对结果进行分析。结果中脑腹侧背盖区GAP-43的蛋白表达随依赖时间的延长表现为先降低再升高（P＜0.01）。结论GAP-43可能在中脑腹侧背盖区参与了吗啡戒断记忆。

法医病理学；吗啡依赖；生长相关蛋白-43；大鼠

近年来研究表明，学习记忆在成瘾行为的形成和保持中发挥了重要的作用，两者具有相同的分子通路、受相同的神经因子调节、数个信号传导通路相同、均有相似的神经元形态适应性改变和突触可塑性变化等[1]。药物成瘾的真正原因就是成瘾记忆，同时成瘾记忆在药物依赖中的作用已受到了高度重视[2]。本研究通过观察吗啡戒断大鼠与成瘾记忆相关的中脑腹侧背盖区生长相关蛋白-43（growth associated protein-43，GAP-43）不同时程的表达，探讨GAP-43在吗啡戒断记忆中的作用。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

盐酸吗啡（1mL∶1mg，沈阳第一制药厂），盐酸纳洛酮（2 mL∶2 mg，北京四环制药厂），兔抗鼠GAP－43多克隆抗体、羊抗兔二抗（北京博奥森生物技术有限公司）。

Olympus BX51生物显微镜（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 吗啡依赖戒断模型的建立

健康SD大鼠24只（3月龄），雌雄不限，体质量（250±20）g，由温州医学院实验动物中心提供。采用腹腔递增注射盐酸吗啡的方法，每天2次（8：00和16：00），连续7 d，每天的剂量依次为5、10、15、20、30、40、50 mg/kg，期间每天称体质量1次。第8天在6：00注射盐酸纳洛酮5mg/kg以诱发戒断症状，参照文献[3]的方法和评分标准，观察大鼠湿狗样颤抖、伸展、清理皮毛、吞咽、站立、跳跃、齿颤、上睑下垂、流涎、腹泻等戒断症状，并进行评分。

1.2.2 实验动物分组

确认成功建立吗啡依赖戒断模型后，按随机原则分为吗啡依赖1周戒断组、2周戒断组、4周戒断组和对照组。每组6只大鼠，分笼喂养，自由进食、饮水。观察其活动、饮食量、饮水量、大便等情况。1周戒断组自然戒断1周，2周戒断组继续给予50mg/kg盐酸吗啡腹腔注射，每天1次（8：00），注射1周后自然戒断1周，4周戒断组按上述方法注射3周后自然戒断1周，对照组采用与实验组相同剂量的生理盐水在相同时间间隔注射。

1.2.3 GAP-43免疫组织化学染色

各组大鼠自然戒断1周后用戊巴比妥钠麻醉，灌注固定，参照鼠立体定位图谱，冠状取中脑腹侧背盖区检材（含周边组织），包埋切片。4组用于比较的组织同贴在一张玻片上，按试剂盒说明书进行免疫组织化学染色。切片脱蜡至水，0.01mol/L、pH=6.0柠檬酸缓冲液高压热抗原修复5min，含3%H2O2的50%乙醇溶液消除内源性过氧化物酶30min，灭活普通羊血清封闭内源性抗原30min，加兔抗鼠GAP-43多克隆抗体，37℃过夜，加羊抗兔二抗，37℃2h，DAB染色，苏木素复染后观察拍片，每个步骤间均用PBS洗片。对照组用灭活普通羊血清取代一抗，其余同模型组。

1.2.4 显微图像分析处理

图1 各组中脑腹侧背盖区GAP-43免疫组织化学染色结果DAB×400

每只大鼠中脑腹侧背盖区取6张切片，每张切片核团区域各取5个视野（×400），用Olympus BX51生物显微镜摄片，Image-Pro Plus 5.1图像分析软件进行光密度测定，并以胼胝体光密度作为基准，得到校正值。

1.3 统计学分析

实验数据用x ±s表示，用t检验进行差异性分析。检验水准α=0.01。

2 结果

2.1 吗啡依赖戒断大鼠模型评分结果

通过对实验大鼠戒断症状的观察，发现吗啡依赖大鼠戒断后出现明显戒断症状，各组戒断症状评分结果见表1。1周、2周、4周戒断组评分均高于对照组（P＜0.01），说明吗啡依赖大鼠模型建立成功。

表1 吗啡依赖戒断症状评分结果（n=6，±s）

表1 吗啡依赖戒断症状评分结果（n=6，±s）

注：1）与对照组比较，P＜0.01

组别戒断症状评分对照2.1±2.2 1周戒断28.2±5.11）2周戒断24.5±3.21）4周戒断22.5±3.91）

2.2 GAP-43免疫组织化学染色结果

在各组实验大鼠中脑腹侧背盖区，神经细胞胞浆和突起内均可见免疫反应产物（棕黄色颗粒）沉积，胶质细胞未见表达。对照组棕黄色颗粒明显且密集，1周戒断组棕黄色颗粒浅淡而稀疏，2周戒断组棕黄色颗粒欠明显但密集，4周戒断组棕黄色颗粒明显且密集（图1）。

用Image-Pro Plus 5.1图像分析软件进行光密度测定，测定结果见表2。通过各组间两两比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。

表2 中脑腹侧背盖区GAP－43光密度测定结果（n=6，±s）

表2 中脑腹侧背盖区GAP－43光密度测定结果（n=6，±s）

注：1）与对照组比较，P＜0.01；2）与上一组比较，P＜0.01

组别GAP－43光密度对照0.3396±0.0115 1周戒断0.1641±0.00931）2周戒断0.2611±0.01061）2）4周戒断0.5984±0.02371）2）

3 讨论

药物成瘾是一个复杂的生物学、心理学和社会学问题，联系着环境刺激和滥用毒品效应的不良适应性记忆被公认为是引起毒品成瘾习惯复燃和持久的主要原因[4]。脑对成瘾药物的反应表现为神经元的适应性改变和突触的可塑性改变，药物成瘾的持续性和牢固性正是神经元结构和突触的可塑性特定模式变化的结果。

本研究选择运用免疫组织化学染色观察吗啡戒断大鼠中脑腹侧被盖区GAP-43不同时程的表达情况，来探讨GAP－43在吗啡戒断记忆中的作用。中脑腹侧被盖区是中枢神经系统中主要的多巴胺能神经元胞体所在的核团，和多个脑区及核团间存在着神经纤维联系。中脑腹侧被盖区发出的多巴胺能神经元投射到前额叶皮层和伏隔核，并接收来自前额叶皮层、海马下托和杏仁核的谷氨酸能神经元的支配。长期反复地摄入精神活性物质会导致中脑腹侧被盖区的神经元出现适应性改变[5]，从而使得前额叶皮层内侧和伏隔核的基础活动增加。最新研究[6]表明，中脑腹侧被盖区中谷氨酸-DA的相互作用可能是可卡因引发复吸行为的基础。GAP-43是神经组织特异性磷酸蛋白，分布于神经元、再生的施旺细胞和神经胶质细胞中，在神经元生长发育、突触的形成和维持、海马长时程增强、神经元信号转导等过程中起重要作用。GAP-43在边缘系统和联络区有丰富表达，而大鼠出生后大部分脑区的GAP-43及其mRNA的表达都大大降低，表明其与长期记忆相关的可塑性改变有关[7]。同时有研究[8-9]表明，在突触重塑过程中，新生发芽末梢中GAP-43含量非常高，只要突触重建进行，即使无轴突延伸，GAP-43的表达也会在高水平表达。而一旦重建完成，GAP-43及其mRNA含量便骤然下降，甚至消失。

本研究发现，吗啡戒断大鼠中脑腹侧背盖区GAP－43的表达趋势随依赖时间的延长表现为先降低后升高，且升高更为明显。前期研究[10]发现，吗啡可引起神经元出现缺血缺氧及退行性改变。本研究戒断1周组大鼠GAP－43表达降低，考虑其原因为吗啡对神经细胞的损伤所引起。GAP－43的活性和含量受神经元活性控制，神经细胞数量减少和活性降低，GAP－43的表达也会随之降低。而GAP－43又是神经元轴突生长发育和可塑性的分子标记物，随着戒断时间的延长，GAP－43表达升高，突触开始重建，提示受损的神经元开始修复。

吗啡对学习记忆的影响是双重的，一方面可以对某些类型的学习记忆造成损害，另一方面，多次给予吗啡也可引起记忆恢复和重新巩固[11-12]，一些不良适应性记忆得到了加强。中脑腹侧背盖区在吗啡依赖形成后，GAP－43的表达与对照组相比出现降低，考虑其与戒断记忆有关。多次给予吗啡导致成瘾记忆得到加强，戒断后GAP－43表达持续增高，也说明GAP－43参与了戒断记忆。而随吗啡对神经细胞损害时间的延长，神经细胞的损害进一步加重，GAP－43的表达也随之进一步增高，以至于超出原有水平。对于吗啡对学习记忆的行为学影响和各脑区GAP－43的基因表达，将作进一步的研究。

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[2]Nestler EJ. Neurobiology.Total recall-the memory of addiction[J]. Science，2001，292（5525）：2266-2267.

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（本文编辑：张建华）

Expression of GAP－43 in Midbrain Ventral Tegmental Area of Morphine Withdrawal Rats

LUO Liang-ming1,2,WU Yu-feng3,NI Wei-cheng4,ZHU Hua1
（1.Department of Forensic Medicine,Wenzhou Medical College,Wenzhou 325035,China;2.Institute of Criminal Science and Technology,Wenzhou Public Security Bureau,Wenzhou 325000,China;3.Criminal Investigation Team,Zhuji Public Security Bureau,Zhuji 311800,China;4.Department of Criminal Technology,Pingyang Public Security Bureau,Pingyang 325400,China）

ObjectiveTo observe the protein expression of growth associated protein-43（GAP-43）in midbrain ventral tegmental area in morphine withdrawal rats at different time,and to evaluate the effect of GAP-43 on morphine withdrawal memory.MethodsRat models of morphine dependent 1 week,2 weeks and 4 weeks were established by morphine hydrochloride intraperitoneal injection with increasing doses to establish natural withdrawal.The protein expression of GAP-43 in midbrain ventral tegmental area was observed by immunohistochemical staining and the results were analyzed by Image-Pro Plus 5.1 image analysis system.ResultsWith prolongation of dependent time,the expression of GAP-43 was decreased then increased in midbrain ventral tegmental area.ConclusionGAP-43 could play a role in morphine withdrawal memory in midbrain ventral tegmental area.

forensic pathology;morphine dependence;growth associated protein-43;rats

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2013.05.003

1004-5619（2013）05-0330-03

浙江省温州市科技局基金资助项目（Y20090237）；浙江省公安厅重大科研资助项目（20110204）

罗良鸣（1978—），男，湖北松滋人，副主任法医师，主要从事法医病理学检验；E-mail：wzrsmart@gmail.com

朱华，男，硕士，副教授，主要从事吸毒的毒理病理和行为学研究；E-mail：wzzhhua@163.com

2012-09-27）