曲晓军，沙长青，李思明，孙建华，于 冲，夏海华，王金英

(1.黑龙江省科学院微生物研究所，哈尔滨150010;2.黑龙江省科学院，哈尔滨150001)

乳酸乳球菌(Lactococcus lactis，L.lactis)是乳球菌属中最典型的一个种，是乳酸菌的重要模式菌(model LAB)。L.lactis归属于硬壁菌门，杆菌纲，乳杆菌目，链球菌科，乳球菌属，细胞呈球形或卵圆形，革兰氏阳性，兼性厌氧，不产荚膜和芽孢，营养要求复杂，最适宜生长温度为30℃。L.lactis广泛存在于乳制品和植物产品中，在食品工业中应用广泛，对人和动物无致病性，是被公认安全的食品级微生物(generally regards as safe，GRAS)。与大肠杆菌、酵母菌相比，L.lactis的分子遗传学方面的研究起步较晚，从20世纪80年代开始，研究者致力于对其生物学性质和分子机制的研究。近年来，L.lactis分子生物学及作用机制的研究取得了重大发展，一系列具有不同用途的L.lactis基因表达系统已逐步建立，并成功地表达了许多外源蛋白［1］，加之L.lactis的完整基因组已经测序完成，因此，构建重组乳酸乳球菌已成为食品工业、生物制药和疫苗研究的热点，被广泛应用于上述领域内。

1 重组L.lactis应用于黏膜免疫疫苗

黏膜是许多病原菌进入肌体的主要通道，在黏膜表面接种以抵御病原体的入侵，不仅是合理的，在某种程度上也是唯一的途径，例如在黏膜表面防御寄生虫和病毒的感染远比感染后再消除这些病原体容易［2］。因此，预防感染的最佳途径就是激发作为肌体第一道屏障的黏膜免疫，阻止病原微生物的入侵。Besrdeka于1919年首先提出了黏膜局部免疫防御系统的概念，黏膜免疫的组织结构基础是由位于胃肠道的孤立淋巴结和集合淋巴结为代表的肠道相关性淋巴组织(Gut associated lymphoid tissue，GALT)、鼻黏膜相关淋巴组织(Nasal assoeiated lymphoid tissue，NALT)、上呼吸道的支气管淋巴组织(Bronehus－assoeiated lymphoid tissue，BALT)、泌尿生殖道黏膜下的淋巴组织和眼部的淋巴组织组成。通过黏膜输送疫苗抗原能够刺激GALT产生局部黏膜和全身系统免疫反应，局部黏膜分泌型IgA抗体(sIgA)，能够阻止病毒的感染、细菌的定植及中和细菌毒素的活性［3－6］。因此，通过鼻黏膜、消化道黏膜或妇女阴道黏膜接种疫苗是一种极其有效的免疫途径。

理想的黏膜免疫活载体疫苗应该是安全、稳定的，能促使抗原和免疫系统之间的有效接触，并能刺激体液和细胞免疫反应，单剂量接种后产生长期的保护。近年来发展了一些新型的抗原递呈载体，如细菌、病毒、惰性颗粒及黏膜上皮黏附因子等。将重组细菌作为抗原递呈载体是近年来基因工程主要的发展方向，目前研究最多的是致弱病原菌载体，如分枝杆菌(mycobacteria)［7］、沙门氏菌(salmonlla)［8］。但因其仍可能保持侵袭性和毒性，对儿童、老人及部分免疫缺陷者有潜在的危险，而且过强的免疫应答会降低后继疫苗的效力，因此，在应用上受到了限制。利用乳酸乳球菌作为抗原递呈载体是近年来新兴的疫苗研制策略，能够克服上述缺陷。乳酸乳球菌被公认为安全级微生物，在疫苗研发方面具有天然的优势，它不在人和动物肠道内定居，具有很小的免疫原性，不会造成免疫麻痹，可重复用作抗原递呈载体;携有多种免疫辅助成分起到免疫修饰作用，如脂多糖、磷脂A及肽聚糖等，可以作为佐剂激活宿主的免疫系统，促进细胞分裂、体液及细胞免疫［9］;乳酸乳球菌分泌蛋白较少，且不分泌细胞外蛋白酶，使得其表达的外源性分泌蛋白易于被检测且不易发生细胞外降解;易于驯化，其遗传学方面的研究及相关技术日臻成熟。因此，乳酸乳球菌是一种理想的黏膜免疫疫苗活载体。

目前，以乳酸乳球菌作为载体来输送疫苗抗原以激发黏膜免疫的研究比较深入，已有多种细菌、病毒的抗原在乳酸乳球菌中表达并用于口服或鼻黏膜接种研究［10－14］，相关的免疫原性也给予了阐述。K.Robinson等［15］在乳酸乳球菌中表达破伤风毒素片段C(TTFC)，并以黏膜免疫的方式免疫小鼠，发现在小鼠肠道中产生特异性IgA抗体和T细胞免疫反应，而且血清中也出现特异性IgG抗体;ZHANG ZH等［16］给小鼠口服表达疟原虫MSP－1(19)蛋白的乳酸乳球菌，小鼠能够产生针对疟疾的保护力;Ribeiro等［17］也在乳酸乳球菌中实现了布鲁氏菌L7/L12抗原的表达。以上试验结果都表明，乳酸乳球菌可有效地将抗原递呈于黏膜免疫系统并诱导特异性免疫应答，证明其具有诱导黏膜免疫应答的能力。目前为止，已有多种细菌及病毒的抗原在乳酸乳球菌中得到有效表达，如表1所示。

2 重组L.lactis表达、传递功能性蛋白及细胞因子

采用重组微生物表达功能性蛋白可以较好地解决传统药理学制备技术存在的药物产量低、成本昂贵、蛋白质易变性等不足。L.lactis是一种理想的外源蛋白表达宿主菌，其表达的外源蛋白在细胞的定位有胞内、胞壁结合和分泌等形式。分泌性表达具有极其显著的优势，可以持续培养，及时将合成的外源蛋白输送到胞外上清中，避免被胞内蛋白酶降解;L.lactis不产生任何细胞外蛋白酶，有利于保持外源蛋白的完整性和功能性;可避免如大肠杆菌表达形成包涵体，无须复性处理，表达蛋白能够正确折叠，保持良好的生物学活性;分泌性表达的蛋白或酶可以直接与作用对象或肠道黏膜接触，无须下游的蛋白纯化操作，且乳酸乳球菌为肠道益生菌，可在肠道中持续表达。目前，乳酸乳球菌已成为重组治疗蛋白及细胞因子表达载体的研究热点，已有多种细胞因子在乳酸乳球菌中表达［18－19］，如表2所示。

表1 乳酸乳球菌表达的细菌及病毒抗原Tab.1 Bacterial and viral antigen of Lactococcus lactis expression

表2 乳酸乳球菌表达的细胞因子Tab.2 Cytokines of Lactococcus lactis expression

IL－10是近年来发现的具有抗炎作用的细胞因子，也称之为细胞因子合成抑制因子，是一种多功能负性调节因子，主要由Th2细胞、活化的B细胞、单核细胞、巨噬细胞产生。它参与免疫细胞、炎症细胞、肿瘤细胞等多种细胞的生物调节，在自身免疫性疾病、严重感染性疾病、肿瘤及移植免疫等多种疾病中发挥重要作用。IL－10在炎症性肠病中是重要的抑炎细胞因子，常用给药方法是口服或注射，但均有一定的局限性。口服给药会因胃肠道中的蛋白酶以及胃液的酸性环境等因素，给细胞因子的传递造成不利的影响;注射给药会引起一定的副作用并可导致炎症因子的诱发。研究者对如何将功能性蛋白及细胞因子有效地传递到病灶展开了研究。Steidler，L等［20］给鼠口服表达分泌型IL－10的乳酸乳球菌，研究发现，DSS(右旋糖酐硫酸酯钠)模型鼠的大肠炎发病率减少了50%;Vandenbroucke，K等［21］亦研究发现分泌型表达三叶因子(TFF)的乳酸乳球菌可有效防治急性鼠源大肠炎。以上研究结果均表明，以重组乳酸乳球菌作为功能性蛋白及细胞因子的表达、传递载体是完全可行的。

3 结语

乳酸乳球菌是一种长期应用于食品工业的有益微生物，近年来乳酸乳球菌分子生物学研究进展迅速，一系列基因表达载体和受体系统逐步建立，已构建了多种重组乳酸乳球菌。重组乳酸乳球菌及其表达产物可直接制成口服制剂，避免了一般基因工程菌复杂、高成本的后期提取工艺，因此，重组乳酸乳球菌在功能食品、医疗保健及微生态制剂、人工口服疫苗等领域具有广阔的应用前景和巨大的商业价值。

［1］ Monne M，Chan KW，Slotboom DJ，et al.Functional expression of eukaryotic membrane proteins in Lactococcus lactis［J］.Protein Sci，2005，(14):3048 －3056.

［2］ Eriksson K，Holmgren J.Recent advances in mueosal vaccines and adjuvants［J］.Curr Opin Immunol，2002，(14):666 －672.

［3］ Brandtzaeg P.Role of secretory antibodies in the defence against infections［J］.Int.J.Med.Microbiol，2003，(293):3 －15.

［4］ Michetti P，Mahan MJ，Slauch JM，et al.Monoclonal secretory immunoglobulin A protects mice against oral challenge with the invasive pathogen Salmonella typhimurium［J］.Infect Immun，1992，(60):1786－1792.

［5］ Taylor HP，Dimmoek NJ.Mechanism of neutralization of influenza virus by secretory IgA is different from that of monomeric IgA or IgG［J］.Exp Med，1985，(161):198 －209.

［6］ Winner L，Mack J，Weltzin R，et al.New model for analysis of mucosal immunity:intestinal secretion of specific monoclonal immunoglobulin A from hybridoma tumors protects against Vibrio cholerae infection［J］.Infect Immun，1991，(59):977 －982.

［7］ Stover CK，de la Cruz JF，Lee MH.New use of BCG for recombinant vaccines［J］.Nature，1991，(351):456 －460.

［8］ Chatfield S N，Dougan G，Roberts M.Progress in the development of multivalent oral vaccines based on live attenuated Salmonella［M］.Plenum press，1994:32 －34.

［9］ Szostak MP，Hensel A，Eko F.Bacterial ghosts:non－living candidate vaccines［J］.Biotechnol，1996，(44):161 －170.

［10］ Norton PM ，Wells JM，Brown HWG，et a1.Protection against tetanus toxin in mice nasally immunised with recombinant Lactococcus lactis expressing tetanus toxin fragment C［J］.Vaccine，1997，(15):616 －619.

［11］ Dieye Y，Hoekman AJ，Clier F，et al.Ability of Lactococcus lactis to export viral capsid antigens:a crucial step for development of live vaccines［J］.Appl Environ Microbiol，2003，(69):7281 －7288.

［12］ Pontes DS，Dorella FA，Ribeiro LA，et al.Induction of partial protection in mice after oral administration of Lactococcus lactis producing Brucella abortus L7/L12 antigen［J］.Drug Target，2003，(11):489－493.

［13］ Bermudez－Humaran LG，Cortez－ Perez NG，Le Loir Y，et al.An inducible surface presentation system improves cellular immunity against human papillomavirus type 16 E7 antigen in mice after nasal administration with recombinant lactococci［J］.Med Mierobiol，2004，(53):427 －433.

［14］ Pei H，Liu J，Cheng Y，et al.Expression of SARS － coronavirus nucleocapsid protein in Escherichia coli and Lactococcus lactis for serodiagnosis and mucosal vaccination［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2005，(68):220 －227.

［15］ Robinson K，Chamberlain LM，Lopez MC，et al.Mucosal and Cellular Immune Responses Elicited by Recombinant Lactococcus lactis Strains Expressing Tetanus Toxin Fragment C［J］.Infection and Immunity，2004，5(72):2753 －2761.

［16］ Zhan ZH，Jiang PH，Li NJ，et al.Oral vaccination of mice against rodent malaria with recombinant Lactococcus lactis expressing MSP －119［J］.World J Gastroenterol，2005，11(44):6975 －6980.

［17］ Ribeiro LA，Azevedo V，Le Loir Y，et al.Production and targeting of the Brucella abortus antigen L7/L12 in Lactococcus lactis:a first step towards food－grade live vaccines against Brucellosis［J］.Appl Environ Microbiol，2002，(68):910 －916.

［18］ Bermudez－Humaran LG，Langella P，Commissaire J，et a1.Controlled intra－orextracellular production of staphylococcal nuclease and ovine omega interferon in Lactococcus lactis［J］.FEMS Microbiol Lett，2003，224(2):307 －313.

［19］ Dieye Y，Usai S，Clier F，et al.Design of a protein － targeting system for lactic acid bacteria［J］.Bacteriol，2001，l83(14):4157－4166.

［20］ Steidler L，et al.Treatment of murine colitis by Lactococcus lactis secreting interleukin － 10［J］.Science，2000，289(5483):1352－1355.

［21］ Vandenbroucke K，et al.Active delivery of trefoil factors by genetically modified Lactococcus lactis prevents and heals acute colitis in mice［J］.Gastroenterology，2004，127(2):502 －513.