何章彪，曹翠萍，刘卫华，赵 琳，魏抗抗，王翠侠，陈奎生

（1.郑州大学第一附属医院病理科，郑州450052；2.商丘医学高等专科学校，河南商丘476100；3.河南省商丘市第一人民医院 476100）

神经轴突导向因子-1（Netrin-1）是层黏连蛋白相关的分泌蛋白，在调节神经轴突生长、缺氧促进肿瘤血管生成、调节白细胞迁移等方面发挥重要作用。而血管内皮生长因子（VEGF）是目前所知的作用最强的促血管形成因子之一，在肿瘤血管形成中起重要作用［1］。有关食管鳞癌组织中Netrin-1、VEGF蛋白及mRNA表达及其意义尚未见文献报道。作者采用免疫组织化学与原位杂交方法观察食管鳞癌组织中Netrin-1、VEGF的蛋白及mRNA表达，从而探讨其与食管癌发生、发展及浸润转移的关系以及VEGF和Netrin-1的相关性。

1 资料与方法

1.1 实验标本 组织标本系河南省商丘市第一人民医院2011年3月至2012年3月食管癌新鲜手术切除标本，共50例，病理检查证实均为鳞癌，并取相应的癌旁不典型增生标本19例及正常食管黏膜标本20例。食管鳞癌患者中，男33例，女17例，年龄40～74岁。50例食管标本按有无淋巴结转移分为：转移组14例和无转移组36例。术前均未接受放化疗。

1.2 实验试剂 Netrin-1、VEGF免疫组织化学SP试剂盒及Netrin-1、VEGF原位杂交试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；VEGF鼠抗人单克隆抗体、Netrin-1兔抗人抗体购买于北京中杉试剂公司；胃蛋白酶、预杂交液及核固红均购自武汉博士德生物工程有限公司；SP-AP（streptavidin A1-kaline phosphatase）及BCIP／NBT购自美国Promega公司，Netrin-1探针（5′-GGA AGT TCA CGG TGA ACA T-3′），VEGF探针（5′-GTC ATG GAA TCC ATC TGT TGA GT-3′）由北京奥科生物技术有限责任公司合成。

1.3 方法

1.3.1 标本处理 食管鳞癌组织、癌旁不典型增生组织及正常食管黏膜组织经40g／L的多聚甲醛固定，石蜡包埋，用于免疫组织化学及原位杂交检测。

1.3.2 免疫组织化学 免疫组织化学SP法染色步骤按照试剂盒及一抗（浓度为1∶100）说明书要求进行，同时用购自武汉博士德公司（Netrin-1）及北京中杉试剂公司（VEGF）的阳性对照片进行阳性对照及用PBS代替一抗作阴性对照。

1.3.3 原位杂交 参照原位杂交试剂盒说明书操作，以不含探针的预杂交液进行杂交及杂交前用RNase处理样本作阴性对照。

1.3.4 免疫组织化学及原位杂交结果判定 在显微镜下观察并计数，每张切片观察10个视野（×200），并取均数。按阳性细胞数所占的百分比分为：阴性：阳性细胞数小于5%；弱阳性：阳性细胞数占5%～25%；阳性：阳性细胞数占25%～50%；强阳性：阳性细胞数大于50%。为便于统计，将弱阳性和阴性归为阴性，阳性和强阳性归为阳性［2］。

1.4 统计学处理 应用SPSS13.0软件数据进行统计分析，行χ2检验及列联表的关联性分析，检验标准α＝0.05。

2 结 果

2.1 免疫组织化学与原位杂交结果 Netrin-1蛋白阳性信号位于正常食管鳞状上皮细胞、食管癌细胞或癌旁不典型增生细胞胞膜，在细胞与细胞的接触面的表达更为清晰，呈棕黄色颗粒（图1A）。Netrin-1mRNA阳性信号位于正常食管鳞状上皮细胞、食管癌癌细胞或癌旁不典型增生细胞胞质中，呈蓝紫色颗粒（图1B）；VEGF蛋白阳性表达主要定位于细胞胞质（图1C）。VEGF mRNA阳性信号位于正常食管鳞状上皮细胞、食管癌癌细胞或癌旁不典型增生细胞胞质中，呈蓝紫色颗粒（图1D）。

2.2 食管鳞癌组织中Netrin-1、VEGF的蛋白及mRNA表达见表1。食管鳞癌组织、癌旁不典型增生组织与正常食管黏膜组织中Netrin-1、VEGF蛋白及mRNA表达，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

图1 食管鳞癌组织中VEGF、Netrin-1蛋白及mRNA的影像学表现（SP，×400）

表1 食管鳞癌组织、癌旁不典型增生组织及其正常组织中Netrin-1、VEGF蛋白及mRNA表达比较［n（%）］

表2 VEGF及mRNA蛋白的表达与淋巴结转移的关系

表3 Netrin-1及mRNA蛋白的表达与淋巴结转移的关系

2.3 Netrin-1及VEGF蛋白表达与食管癌转移的关系 见表2～3。有淋巴结转移的食管鳞癌组织中Netrin-1蛋白及mRNA、VEGF蛋白及mRNA表达均高于无淋巴结转移的相应组织（P＜0.05）。

2.4 VEGF和Netrin-1的相关性 在VEGF蛋白表达阳性病例中，Netrin-1蛋白表达阳性率为91.18%（31／34），VEGF蛋白表达阴性病例中Netrin-1蛋白表达阳性12.50%（2／16），经统计学分析，结果显示列联系数（contingency coefficient）r＝0.941 3，P＜0.01，提示两种蛋白在食管癌组织中的表达成正相关性。在VEGF mRNA表达阳性病例中，Netrin-1mRNA表达阳性率为89.29%（25／28），VEGF mRNA表达阴性病例中 Netrin-1mRNA表达阳性率为9.09%（2／22），经统计学分析，结果显示列联系数r＝0.584 7，P＜0.01，提示两种 mRNA在食管癌组织中的表达成正相关性。

3 讨 论

Netrin家族是一类与层黏连蛋白相关的可分泌蛋白，也是重要的神经突起导向因子，在结构上高度保守［3］。Netrin-1是Netrin基因家族中研究较多的重要成员之一。近年研究结果显示，Netrin-1可通过调节肿瘤血管生成调节肿瘤的形态发生和发展、转移［4］。2004年，Park等［5］在 PNAS上率先报道 Netrin-1是一血管生成因子，既能促进内皮细胞增生、迁移和黏附，增生效应类似于经典的内皮细胞促进因子——血管内皮生长因子；又能促平滑肌细胞增生，效应等同于经典的平滑肌细胞促进因子——血小板源性生长因子。几乎与此同时，Fitamant等［6］报道，去除Netrin-l基因表达，会导致内皮端细胞伪足迷乱、过度分支和方向异常，提示Netrin-l具有调控血管方向和形态发生功能。

Netrin-1与恶性肿瘤侵袭性的关系也受到重视。Otrock等［7］基于Netrin-l转基因小鼠的研究证实，Netrin-l在转基因小鼠的结肠中高表达，而其受体DCC和UNC5H在所有肠上皮细胞中均有表达，与之相应的表型是结肠增生和腺瘤发生频率增高，提示Netrin-1可能作为原癌基因在结肠癌的早期发挥重要作用。Mehlen等［8］发现Netrin-1与乳腺癌细胞的存活及转移关系密切，认为Netrin-1有利于转移的乳腺癌细胞存活，但不足以导致形成癌细胞转移灶；Netrin-l的表达量有利于判断乳腺癌的转移性，如乳腺癌组织中Netrin-l高表达，则转移性强。近来有研究表明，在92例非小细胞肺癌中，Netrin-1高表达的有43例（占47%）；且通过增强或减弱Netrin-1表达对肿瘤的影响研究可能存在的联系，结果提示Netrin-1有可能成为治疗肺癌的新靶点［9］。本研究显示Netrin-1表达在淋巴转移的患者中阳性表达明显升高，表明Netrin-l在食管癌中的表达上调可能在食管癌癌细胞侵袭转移过程中发挥重要作用。实验结果显示Netrin-1在食管癌侵袭转移过程中扮演重要角色，可能被作为肿瘤基因治疗的新靶点进行研究。

VEGF是目前已知作用最强的促血管形成因子之一，也是肿瘤细胞分泌的血管形成因子中最重要的一种，新血管形成是保证肿瘤生长和转移的组织学基础，受多种促血管因子和抗血管生成因子的双重调节。据报道，食管鳞癌阳性率为23.9%～93.3%，本研究为68.0%。VEGF主要表达于癌细胞，具有明显的异质性，强阳性表达的细胞多位于浸润前缘，在血管内皮不表达或极少量表达，与 Mbius等［10］的报道相似。推测VEGF主要以旁分泌途径作用于血管内皮细胞。VEGF是高度特异的血管内皮细胞有丝分裂原［11］，是肿瘤新生血管生成的重要调控因子［12］，不仅参与肿瘤血管生成、增殖，还直接与肿瘤浸润转移有关，且其表达水平与肿瘤的恶性程度有关［13］。VEGF与食管鳞状细胞癌的浸润程度、淋巴结转移呈正相关。因此，可以作为判定食管癌生物学行为的检测及预后指标［14］。本研究显示，VEGF在食管癌中的表达与癌旁非典型增生组织及正常食管黏膜组织比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。提示VEGF可诱导食管癌肿瘤血管形成，提高其通透性，促使肿瘤细胞浸润转移、恶性程度增加。

VEGF是目前已知作用最强的促血管形成因子之一，而Netrin-1可通过调节肿瘤血管生成调节肿瘤的形态发生和发展、转移［15］。因此，Netrin-1和VEGF基因蛋白之间可能有协同作用。实验结果显示Netrin-1和VEGF基因蛋白在正常食管黏膜组织中基本不表达，而在食管癌组织中有不同程度的阳性表达，食管癌中VEGF及Netrin-1的表达存在正相关性。它们以不同的机制促进了食管癌的发生、发展、侵袭和转移。对食管癌患者进行Netrin-1和VEGF的联合检测，有可能作为食管癌的诊断和评估其预后的重要分子生物学指标。判断食管癌的侵袭和转移能力，为术后高危患者制订合理的治疗方案及防止肿瘤的复发和转移提供可靠的依据。但是，在体内食管癌侵袭、转移过程中，Netrin-1基因的作用及其分子机制，还有待进一步研究。

［1］Michael PS，Margarete S.To die or not to die，that′s the question and the answer may depend on netrin-l［J］.J Natl Cancer，2009，101（4）：217-219.

［2］庞霞，郑湘予，李晟磊，等.食管鳞状细胞癌组织中血管内皮生长因子-C与血小板生成因子-4蛋白的表达［J］.郑州大学学报：医学版，2008，43（7）：865-867.

［3］Ngoe PL，Katsumi K，lain PF，et al.Netrin-1inhibits leukocyte migration in vitro and in vivo［J］.Pmc Nail Acad Sci，2005，102（31）：4729-4734.

［4］Lu XH，Noble F，Jiang Q，et al.The netrin-1receptor UNCSB mediatesguidance events controlling morphogenesis of the vascular system［J］.Nature，2004，43（2）：179-186.

［5］Park M，Fume C.Netrin-1：when a neuronal guidance cue turns out to be a regulator of tumorigenesis［J］.Cell Mol Life Sci，2005，62（22）：2599-2616.

［6］Fitamant J，Guenebeaud C，Coissieux MM，et al.Netrin-1 expression confers a selective advantage for tumor cell survival in metastatic breast cancer［J］.Proc Nail Aead Sci USA，2008，105（12）：4850-4855.

［7］Otrock ZK，Malafouz RA，Makarem JA，et al.Undemtanding the biology of angiogenesis：Review of the most important molecular mechanisms［J］.Blood Cell Mol Dis，2007，39（2）：212-220.

［8］Mehlen P，Liambi F.Role of netrin-1and netrin-1dependencereceptors in colorectal cancers［J］.Br J cancer，2005，93（1）：1-6.

［9］El-Serag HB，Rudolph KL.Hepatocellular carcinoma：epidemiologyand molecular carcinogenesis［J］.Gastroenterology，2007，132（15）：2557-2576.

［10］Mbius C，Freire J，Becker I，et al.VEGF-C expression in squamous cell carcinoma and adenocarcinoma of the esophagus［J］.World J Surg，2007，31（9）：1768-1770.

［11］Gonzalez-Quevedo R，Shoffer M，Horng L，et al.Receptor tyrosine phosphatase-dependent cytoskeletal remodeling by the hedgehog-responsive gene MIM／BEC4［J］.Cell Biol，2005，168（3）：453-463.

［12］Herskovic A，Russell W，Liptay M，et al.Esophageal carcinoma advances in treatment results forlocally advanced disease：review［J］.Ann Oncol，2012，23（5）：1095-1103.

［13］Qian H，Lu N，Xue L，et al.Reduced MTAl expression by RNAi inhibits invitro invasion and migration of esophageal squamous cell carcinoma cell line［J］.Clin Exp Metastasis，2005，22（8）：653-662.

［14］Bompard G，Sharps J，Freiss G，et al.Involvement of Rac in actin cytoskeleton rearrang ements induced by mim B［J］.J Cell Sci，2005，18（14）：5393-5403.

［15］Callahan CA，Oostad T，Horng JK，et al.MIM／BEG4，a sonic hedgehog respinsire gene that potentiates Gli dependent transcription［J］.Gense Der，2004，18（13）：2724-2729.