低出生体重小鼠模型制备及左、右归丸对其骨髓细胞数量及功能的影响

2013-03-02降央泽仁黄晓芹

中国民族民间医药 2013年3期

关键词：生理盐水产率骨髓

降央泽仁黄茜黄晓芹

成都中医药大学民族医药学院，四川成都 610075

低出生体重小鼠模型制备及左、右归丸对其骨髓细胞数量及功能的影响

降央泽仁黄茜黄晓芹

成都中医药大学民族医药学院，四川成都 610075

目的：研究左、右归丸对先天之精不足之低出生体重小鼠骨髓细胞数量及功能的影响，探究左、右归丸补肾作用的生物学实质。方法：通过孕鼠饥饿法得到低出生体重小鼠，仔鼠自5～10周，分别灌胃左、右归丸后，检测骨髓有核细胞数、骨髓各系造血祖细胞集落产率、骨髓基质细胞粘附能力并与正常和灌胃生理盐水及未灌胃组比较。结果：模型组新生仔鼠体重极显著低于正常组新生仔鼠；各模型组的骨髓有核细胞数均低于正常小鼠；右归丸组的骨髓有核细胞数量显著高于生理盐水组；模型小鼠各组的CFU－GM、CFU－E、BFU－E祖细胞集落产率和生理盐水组、空白组的CFU－Meg集落产率均极显著低于正常小鼠；右归丸组CFU－GM集落产率、左归丸CFU－E、CFU－Meg集落产率分别高于生理盐水组；基质细胞体外培养的7、14、21天，空白组和生理盐水组的基质细胞黏附能力均显著低于正常组，在第7天，左、右归丸组基质细胞黏附能力均显著低于正常组、显著高于模型空白和模型盐水组；在14天和21天时，左右归丸组与正常组相比无差异；且在14天时，右归丸高于生理盐水组；在21天时，左、右归丸组均高于生理盐水组。结论：孕鼠饥饿法得到的低出生体重小鼠骨髓细胞数量和部分功能显著低于正常小鼠，左、右归丸能不同程度、不同角度地促进低出生体重小鼠骨髓细胞数量提高和功能恢复。这可能是左、右归丸对先天之精不足小鼠发挥“补肾”作用的途径之一。

低出生体重；小鼠模型；左归丸；右归丸；骨髓细胞

近年来，部分学者开始注意到干细胞与先天之精间的相似性，从干细胞角度对先天之精和肾为先天之本的理论进行了讨论［1－4］，提出了从干细胞角度探讨肾精和肾为先天之本的思路。我们在这一理论指导下，研究了中医常用补益剂左、右归丸对低出生体重的先天不足小鼠骨髓细胞的影响，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 10周龄C57BL6J小鼠，购买于四川大学实验动物中心。

1.2 主要药品及试剂左归丸：河南省宛西制药股份有限公司，国药准字Z41020696，右归丸：河南省宛西制药股份有限公司，国药准字Z41022170，IMDM培养基：美国Invitrogen公司，马血清：北京元亨圣马生物技术研究所，重组人促红细胞生成素：上海普欣生物技术有限公司，重组小鼠白细胞介素－3，重组小鼠粒单系集落刺激因子：Peprotech，重组小鼠促血小板生成素：Peprotech，琼脂粉：日本Solarbio公司。

1.3 仪器设备 CO2培养箱：MCD－15A型，日本SANYO公司；超净工作台：SW－CJ－2FD型，苏州安泰空气技术有限公司；倒置相差显微镜：Olympus IMT－2型；24－48孔细胞培养板：加拿大JET Biochemical Int′l；Inc，等。

1.4 低出生体重小鼠模型的制备综合参考刘殿峰［5］、程志清［6］等人的方法进行，具体操作见表1。

1.5 动物分组及处理 5周龄正常幼鼠（雌雄随机）为正常组、5周龄模型幼鼠（雌雄随机）分为空白组、左归丸组、右归丸组、生理盐水组，每组10只。除正常组、空白组外，其余各组分别灌胃生理盐水、左归丸（3.0g· kg－1）、右归丸（3.0 g·kg－1）和等体积生理盐水，bid×5周。最后一次灌胃后24小时，处死小鼠，分离小鼠股骨骨髓细胞（bone marrow cell，BMC），分别进行骨髓有核细胞计数、常规祖细胞集落培养计数和基质细胞培养。在基质细胞培养第7d、14d、21d进行基质细胞的粘附力测定。测定时吸出培养液，PBS轻轻冲洗2次，去除悬浮细胞后，各孔加入细胞密度为5×105/ml正常小鼠BMC 1ml，37℃，5%CO2培养箱培养2h后，用培养液轻轻冲洗2次，收集并计数未粘附的BMC，按下列公式计算骨髓基质细胞对正常BMC的粘附能力：

粘附力＝（1－未粘附细胞数/5×105）×100%

表1 低出生体重小鼠模型的制备过程

1.6 实验数据的统计分析实验结果用均值±标准差表示，多组间比较用单因素方差分析，P＜0.05视为有显著性差异。

2 结果

2.1 低出生体重小鼠造模结果实验中得到的正常组新生仔鼠和模型组新生仔鼠，体重分别为1.489±0.165和1.259±0.128（g/只），P＜0.01。

2.2 骨髓有核细胞数的变化（见表2）

表2 灌胃左、右归丸后低出生体重小鼠骨髓有核细胞数（×109个）

可见，低出生体重小鼠的骨髓有核细胞数均低于正常小鼠（P＜0.01）；灌胃左归丸后，低出生体重小鼠的骨髓有核细胞数量显著高于空白组但与生理盐水组相比无显著差异（P＞0.05）；灌胃右归丸组则显著高于空白组和生理盐水组（P＜0.05）。2.3 骨髓祖细胞集落产率变化粒－巨噬系祖细胞（Clony Forming Unit－Granulocyte，Macrophage，CFU－GM）、晚期红系祖细胞（Colonies Forming Unit－Erythrocyte，CFUE）、早期红系祖细胞（Burst Forming Unit－Erythrocyte，BFU－E）、巨核系祖细胞（Colonies Forming Unit－ Megakaryocye，CFU－Meg）集落产率变化见表3。

从表中可以看出：模型小鼠各组的CFU－GM、CFUE、BFU－E祖细胞集落产率均极显著低于正常小鼠（P＜0.01）；右归丸组CFU－GM集落产率高于模型空白和模型盐水组（P＜0.05）；左归丸CFU－E集落产率高于模型空白和模型盐水组（P＜0.05）；生理盐水组和空白组的CFU－Meg集落产率显著低于正常小鼠（P＜0.05），但左、右归丸组与正常小鼠相比无显著差异（P＞0.05），左归丸组的CFU－Meg集落产率还显著高于生理盐水组（P＜0.05）。

表3 灌胃左、右归丸后低出生体重小鼠骨髓造血祖细胞集落产率（/5×410BMC）

表4 灌胃左、右归丸后低出生体重小鼠骨髓基质细胞粘附能力（±s）%

*：p＜0.05，与正常组相比，△：p＜0.05，与模型空白组相比，☆：p＜0.05，与生理盐水相比

组别正常空白生理盐水左归丸右归丸7d 30.07±3.50 22.41±4.17* 21.94±5.07* 20.07±6.77*△☆ 29.35±5.89△☆*14d 34.27±3.77 22.10±4.60* 23.18±6.34* 29.90±6.75△ 31.21±7.88△☆21d 34.02±4.02 22.48±5.36* 21.98±4.92* 30.05±9.01☆ 32.201±7.22△☆

2.4 骨髓基质细胞黏附力可见，在各个时间点，空白组和生理盐水组的基质细胞对正常骨髓细胞的黏附能力均显著低于正常组（P＜0.05），在培养第7天，左、右归丸组基质细胞黏附能力均显著高于模型空白和模型盐水组（P＜0.05），但均显著低于正常组（P＜0.05）；在培养第14天和21天时，时，左右归丸组与正常组相比无差异（P＞0.05）；在14天时，左归丸高于空白组，右归丸高于空白和生理盐水组（P＜0.05）；在21天时，左归丸高于生理盐水，右归丸高于空白和生理盐水组（P＜0.05）。详见表4。

3 讨论

祖国医学认为：肾中所藏先天之精，禀受于父母，与生俱来，是人类生命的本原，“人始生，先成精”，故肾为先天之本。在胚胎发育和脏腑器官形成乃至于出生后的生命历程中，先天之精不断地由肾输注于各脏腑器官，在后天之精的充养下，维持着各个脏腑组织器官的形态和功能稳定，若先天之精异常，则会导致禀赋异常，继而产生相应的出生缺陷［7］。低体重儿是由于母亲在怀孕后熟人，营养不良或疾结果病因素等安排导致协和胎儿发育迟缓，在出生时体重过低，见到皮下脂肪少，保温能力拼命差，呼吸机能和代谢机能沟通弱，穷人专门容易感染疾病，死亡率比体重副作用正常的新生儿高，其智力发展也会受到一定的影响［8］关系。因此“低出生体重”是一种典型的先天之精不足导致的出生缺陷。

我们采用孕鼠饥饿法对受孕前后的雌鼠进行饮食限制，结果得到的新生小鼠平均体重显著低于正常新生小鼠，正常喂养10周后，低出生体重小鼠骨髓有核细胞数、骨髓CFU－GM、CFU－E、BFU－E祖细胞集落产率、骨髓基质细胞体外培养的7、14、21天的黏附能力均显著低于正常组，提示用孕鼠饥饿法可以得到出生体重和我们所检测的部分生理指标均低于正常组的“先天之精不足”小鼠。

最原始的干细胞是胚胎干细胞，又称为全能干细胞，其禀受于父母，父母的生殖之精结合为受精卵，再由受精卵分裂出胚泡的内细胞群，新个体所有的组织细胞均由该群细胞分化、分裂而来，其中任何一个内细胞群的细胞在适宜的条件下均可分化成为身体的任何一种组织细胞，故该群细胞被称为胚胎干细胞或全能干细胞。随着胚胎的发育和脏腑器官的分化和成熟，胚胎干细胞逐渐失去了全面分化的能力，而逐渐迁移到各种器官组织中（五脏皆藏先天之精和后天之精）成为特定的组织干细胞（造血干细胞、间充质干细胞、生殖干细胞、神经干细胞、皮肤干细胞等），组织干细胞通过分裂和多向分化，成为这些组织器官生长、发育、修复的原始基础（先天生后天）。组织干细胞在后天所得到的水谷精微的充养下，能够以不对称分裂的形式得以自我更新（后天养先天），维持着数量的动态平衡，从而保证了机体器官和脏腑组织正常的形态和功能的维持［9］。可见干细胞与先天之精在来源、功能和充养（维持）上均具有共通点，为此有作者认为干细胞可能是先天之精在细胞层面的存在形式，并提出从干细胞角度研究肾精的思路［10－12］。

肾精具有生髓化血的作用：肾精生髓，充养于骨，髓亦可以转化为血成为血液的生成来源之一“血即精之属也”。而现代医学研究显示所有的造血细胞均来源于胚胎时期就已具备的造血干细胞，在人的一生中，造血干细胞通过自我更新、不断分裂和多向分化，维持着血细胞数量的动态平衡。因此造血干细胞是研究干细胞与肾精关系的突破点之一。在哺乳动物，造血干细胞主要存在于骨髓有核细胞群中。

左、右归丸是祖国医学常用的补益剂［13］，分别具有滋阴补肾、填精益髓和温补肾阳、填精益髓的功效。为此，我们以干细胞即是先天之精、肾精生髓化血为理论指导，首次研究了左、右归丸对“先天之精不足”之低出生体重小鼠骨髓有核细胞细胞数量、骨髓造血细胞增殖能力、骨髓基质细胞黏附能力的影响，结果显示右归丸组的骨髓有核细胞数量、CFU－GM集落产率、7、14、21天的基质细胞黏附能力均显著高于生理盐水组；左归丸组CFU－E、CFU－Meg集落产率、7、21天的基质细胞黏附能力显著高于生理盐水组，但左右归丸组的各项检测指标间均没有显著性差异。提示左、右归丸能不同程度、不同角度地促进低出生体重小鼠骨髓细胞数量提高和功能恢复，这是左、右归丸对“先天之精不足”小鼠发挥“补肾”作用的途径之一。

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