■黄福勇 何晓明 石 灏

(浙江省水产质量检测中心，浙江杭州 310012）

三聚氰胺(Melamine)又名蜜胺、氰尿酰胺、三聚氰酰胺，分子式为C3N6H6，是一种以尿素为原料生产的氮杂环有机化工原料，主要作为生产塑料树脂的原料[1]，同时广泛用于木材、塑料、涂料、造纸、纺织、皮革、电气、医药等行业[2]。研究资料表明，动物长期摄入三聚氰胺会造成生殖、泌尿系统的损害，导致膀胱、肾部结石等，而氰酸和三聚氰胺反应会产生可能阻碍肾脏功能的结晶[3]。三聚氰胺高温下可能分解产生氰化物，动物食用后可以使动物发生肾衰竭并导致死亡[4]。

加速溶剂萃取是一种在较高的温度和较大的压力下用溶剂萃取固体或半固体的样品前处理方法，具有有机溶剂用量少、萃取速度快、样品回收率高等优点，已广泛应用于各种样品的前处理。本试验采用固相萃取法进行净化处理，通过对不同提取试剂、不同提取方法的比较研究，优化并确定了饲料中三聚氰胺残留检测的加速溶剂萃取-固相萃取-气相色谱-质谱法。

1 仪器与试剂

1.1 仪器与试剂

戴安ASE 300加速溶剂萃取仪；安捷伦6890N-5973气相色谱质谱联用仪；上海科导超声仪器有限公司SK15GT型超声波提取仪；瑞士密理博MILLIPORE Q-GARD 1超纯水仪；北京京立LG10-2.4A台式高速离心机；美国沃特世Waters Oasis MCX固相萃取柱（60 mg/3 ml）。

试验试剂除特别注明均按NY/T1372—2007标准要求准备，甲醇、吡啶为色谱纯，其余试剂为分析纯，水为制备超纯水；衍生化试剂为N，O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺(BSTFA)和三甲基氯硅烷（TMCS），体积比99∶1。

三聚氰胺标准品购自Sigma公司，4℃冰箱保存，临用时用甲醇水溶液（V∶V=1∶4）配成合适浓度的标准溶液。

1.2 加速溶剂萃取条件

压力：1 500 psi；温度：100 ℃；加热时间：5 min；静态萃取时间：5 min；清洗体积：占萃取池体积的60%；吹扫时间：100 s；静态循环次数：2次。

1.3 气相色谱-质谱条件

色谱柱：HP-5MS，柱长30 m，内径0.25 mm，膜厚0.25 μm；载气：氦气；流速：1.3 ml/min；进样口温度：250 ℃；进样量：1 μl，不分流；升温程序：起始温度75℃，持续1.0 min，以30℃/min升温至300℃，保持2.0 min。

传输线温度：280℃；离子源温度：230℃；EI源轰击能：70 eV；质量扫描范围：60～400 m/z；运行时间：10.5 min；扫描模式：选择离子扫描。监测离子99、171、327、342 m/z，选定327 m/z为定量离子。

2 分析步骤

2.1 样品制备

2.1.1 饲料样品制备

饲料样品为甲鱼膨化配合饲料，经粉碎、研磨后过筛，并干燥保存，同时进行6次平行检测，均未检出三聚氰胺。

2.1.2 阳性样品制备

选取日常检测中检出的阳性样品，为某品牌乌龟配合饲料幼龟专用料，经粉碎、研磨后过筛，并干燥保存，作为本试验的阳性样品。

2.2 提取

2.2.1 加速溶剂萃取方法

称量取样5.0 g，取33 ml萃取池，以海砂（粒度为0.65～0.85 mm）为填料，与称量的样品混合均匀后转入萃取池中，以甲醇水溶液（V∶V=1∶4）为溶剂萃取。萃取液以甲醇水溶液（V∶V=1∶4）稀释定容到25 ml，取上层提取液8.0 ml转入离心管，在10 000 r/min的转速下离心30 min。

2.2.2 超声波提取方法

称量管中先放5.0 g海砂(粒度为0.65～0.85 mm),再称量取样5.0 g，准确加入10%的三氯乙酸溶液25 ml。摇匀，超声提取20 min，静置2 min，取上层提取液8.0 ml转入离心管，在10 000 r/min的转速下离心30 min。

2.3 净化及衍生化

分别用3 ml甲醇，3 ml水活化Waters Oasis MCX柱，准确移取5.0 ml离心液分次上柱,控制过柱速度在1滴/s左右，依次用3 ml水、3 ml甲醇洗涤Waters Oasis MCX柱，然后用3 ml氨水/甲醇溶液(体积比为5∶95)洗脱，收集洗脱液并用氮吹至干，加入100 μl吡啶和100 μl衍生剂，混匀，70 ℃反应30 min，转入微量进样管，立即进行GC-MS测定。

3 结果与分析

3.1 线性范围

准确移取适当的三聚氰胺标准溶液，分别用甲醇水溶液（V∶V=1∶4）配制成5种不同质量浓度（0.125、0.25、2.5、10.0、25.0 μg/ml）的标准工作液，取200 μl，氮吹至干，按2.3节方法衍生化后，GC/MS上样测定。得到线性方程y=8.86×104x-2.49×104(R2=0.999）。三聚氰胺标准品SIM质谱图见图1。

图1 三聚氰胺标准品SIM质谱

3.2 色谱柱选择

分别用HP-5MS色谱柱与DB-35MS色谱柱进样，仪器参数及升温程序均相同，结果表明，使用两种柱子均可以得到低浓度三聚氰胺标准工作液的谱图，并能精确定量。因此在检测中，可以采用HP-5MS柱和DB-35MS柱进行阳性样品的双柱检验。此外，使用HP-5MS柱三聚氰胺的响应值约为DB-35MS色谱柱的1.71倍，因此，HP-5MS柱对三聚氰胺的检测更为灵敏，检测效率更高，本试验选用HP-5MS柱。

3.3 提取溶剂的选择

NY/T 1372—2007标准中，采用10%的三氯乙酸溶液作为提取溶剂，用超声提取法进行提取。本试验中超声提取法按NY/T 1372—2007标准进行，同时加入5.0 g海砂，可以有效降低饲料样品表面强度，尤其能促进提取溶剂对粉状样品的浸润，从而提高提取效率。

由于三氯乙酸溶液具有较强腐蚀性，对加速溶剂萃取仪的萃取池和内部管路均有一定的腐蚀作用，容易造成机器故障，本试验中加速溶剂萃取方法选用甲醇水溶液（V∶V=1∶4）替代10%三氯乙酸溶液作为提取溶剂。试验结果表明，采用上述方法，三聚氰胺色谱图杂峰较少，且不会对三聚氰胺目标峰造成干扰，符合检测分析要求。

3.4 回收率试验和提取效率试验

3.4.1 回收率试验

取5.00 g饲料样品，添加3个不同浓度的三聚氰胺标准工作溶液（0.5、2.0、4.0 mg/kg）（n=6），按照上述2.2、2.3节方法进行样品提取和净化，计算平均回收率和批间相对标准偏差（RSD），将10倍背景相应的标准差作为最低定量限（LOQ），试验结果得出本方法对饲料中的最低检测限为0.05 mg/kg。结果表明，使用加速溶剂萃取法，饲料样品三聚氰胺加标回收率为80.1%～86.3%，超声提取法加标回收率为78.9%～85.6%，RSD均小于10%，两种方法的加标回收率都能满足检测要求。

3.4.2 提取效率试验

对阳性饲料样品分别采用加速溶剂萃取法和超声提取法进行处理、测定，加速溶剂萃取法测定样品三聚氰胺含量平均值为19.50 mg/kg，RSD为4.79%(n=6)，超声提取法测定样品三聚氰胺含量平均值为14.84 mg/kg，RSD为9.53%(n=6)，用SPSS 18.0软件进行分析，表明二者存在显著差异，加速溶剂萃取法提取效率较超声提取法高23.90%，加速溶剂萃取法的提取效率显著优于超声提取法。阳性样品加速溶剂萃取法色谱图见图2。

图2 阳性样品加速溶剂萃取法萃取色谱

4 结论

本文建立了加速溶剂萃取-固相萃取-气相色谱-质谱法测定饲料中三聚氰胺残留，优化了试验条件。使用加速溶剂萃取技术，能够提升三聚氰胺提取效率，对阳性样品的提取效率显著高于超声萃取法，本试验条件下高达23.90%。原因在于加速溶剂萃取方法利用升高温度和压力，增加物质的溶解度和溶质溶解效率，并可以降低饲料样品提取液的黏度和基质表面强度，克服溶剂与基质之间的作用力，同时还可以提高溶剂沸点，使之保持液态，促进溶剂进入基质微孔，从而显著提高提取效率。目前，国内质检机构开展饲料中三聚氰胺检测主要采用NY/T 1372—2007《饲料中三聚氰胺的测定》方法，该方法中样品提取仍然是使用超声萃取法，本文结果表明，该方法存在一定局限性，可能存在无法完全提取饲料中三聚氰胺残留的情况。