■杨小佳 王金水 蔺丹华 周 扬 杨 森

（1.河南工业大学粮油食品学院，河南郑州 450001；2.河南工业大学生物工程学院，河南郑州 450001)

相对于花生粕、菜籽粕及棉籽粕等植物蛋白，豆粕蛋白质含量较高，且含有丰富的赖氨酸、蛋氨酸等限制性必需氨基酸，能够满足一般动物对蛋白质的需求，是最佳的植物蛋白原料。但豆粕中存在的一些抗营养因子，如胰蛋白酶抑制剂、大豆凝集素与抗原蛋白等，影响动物对营养物质的吸收[1-2]，降低了豆粕的营养价值；而且大豆蛋白结构较复杂，动物不易消化吸收。而利用微生物发酵处理的豆粕，大豆蛋白被微生物分泌的蛋白酶酶解，抗营养因子被消除[3]，提高了豆粕的营养价值,动物试验表明发酵豆粕可以促进动物的生长[4]。而且酶解过程生成了低分子的肽类物质，这些分子量在5 000 u以下的肽类物质具有抗氧化性[5-6]、调节机体免疫[7]等生物活性，而且提高了蛋白质的消化率[8]，是理想的蛋白原料，在饲料工业领域具有广泛的用途。

但目前富肽蛋白原料的生产多集中于利用蛋白酶酶解大豆蛋白，其成本较高，且产生大量废水，而利用固态发酵技术生产富肽蛋白原料，将传统的固态发酵技术与现代生物技术结合，具有成本低，绿色节能的特点。富肽蛋白的固态发酵过程可以分为两个阶段：①微生物的生长及蛋白酶的分泌；②蛋白酶酶解大豆蛋白，生成低分子的肽类物质。而且微生物产酶的最适温度与蛋白酶酶解最适温度不同[9]，因此通过变温发酵可以提高蛋白酶的酶解速率，产生更多的肽类物质。本文将研究浅盘式反应器制备富肽蛋白时发酵因素对蛋白酶产率的影响，利用响应曲面法（RSM），以发酵豆粕蛋白酶酶活力为指标，对发酵时间、发酵温度、层厚度与基质含水量几个因素进行优化，寻求最优的产酶条件，然后以变温发酵制备富肽蛋白，为固态发酵生产富肽蛋白提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

豆粕：河南阳光油脂集团提供。

枯草芽孢杆菌：BS-GA15，润盈生物工程（上海）有限公司提供。

浅盘式反应器设计尺寸：底盘直径10 cm，高度5 cm，底盘网格直径1 mm。

种子培养基：牛肉膏0.3 g、蛋白胨1.0 g、NaCl 0.5 g，溶解于100 ml水中，调节pH值至7.2～7.4，121℃灭菌20 min。

1.2 方法

发酵豆粕蛋白酶酶活测定：采用SBT 10317—1999蛋白酶活力测定法。

发酵豆粕粗蛋白测定：采用GB/T 6432—94饲料中粗蛋白测定方法。

发酵豆粕酸溶蛋白测定：采用GB/T 22492—2008大豆肽粉中酸溶蛋白含量测定方法。

试验方法：取活化的枯草芽孢杆菌一环，接种于盛有100 ml种子培养基的500 ml锥形瓶中，在恒温培养箱中30℃，200 r/min培养8 h，然后接种于豆粕培养基中，接种量为10 g（豆粕）/ml（种子液），按试验设计调节各样品的含水量、层厚度，在设定好的温度与时间下发酵。

恒温发酵：发酵温度30℃、层厚度1.75 cm、基质含水量44%，每12 h取样1次，发酵72 h。

变温发酵：初始发酵条件为发酵温度30℃、层厚度1.75 cm、基质含水量44%，发酵44 h后发酵温度转变为40℃，每12 h取样1次，发酵72 h。

试验设计与统计分析：由前期单因素影响试验可知，发酵温度30℃、层厚度2.0 cm、基质含水量40%及发酵时间42 h时发酵豆粕中的蛋白酶活力最高，从而确定发酵温度、层厚度、基质含水量及发酵时间4个因素为优化对象（自变量）。试验设计采用Box-Behnken模型，4个因素优化因素依次以X1、X2、X3、X4表示，以方程 Xi=(xi-x0)/△x对自变量编码，方程式中Xi为自变量的编码值，xi为自变量的真实值，x0为试验中心点处自变量的真实值，△x为自变量的变化步长，因子编码及各自变量水平见表1。

表1 试验因素水平及编码

统计分析应用SAS 9.1.3统计软件处理，该回归模型的拟合曲线可有二次多项式方程表达：Y=

式中，Y为蛋白酶活力（响应值）；A0为常数项；Ai为线性系数；Aii为二次项系数；Aij为交叉项系数；Xi、Xj为自变量编码。为求方程中的系数，共设定27组试验，其中24个为析因点，3个为中心点（3次平行试验，以估算误差），其试验设计见表2。

2 结果与讨论

2.1 响应曲面优化试验

利用SAS 9.1.3统计软件对表2的试验数据进行响应面回归拟合处理，其回归模型方差分析见表3。由表3可知，本试验选用的回归模型极显著(P＜0.000 1)，失拟性检验分析得 F2=1.66，相应的P值为0.433 9，而且其相关系数R2=0.940 2，说明该回归方程无失拟因素存在，回归模型与实测值能较好地拟和；利用SAS软件分析27组试验蛋白酶活力的预测值和实际值之间的相关系数，其结果为0.951 5，相应的P＜0.000 1，说明试验利用响应曲面法优化发酵豆粕中蛋白酶产率具有科学性。

表2 试验设计与结果

表3 回归模型的方差分析

由拟合结果可知，发酵豆粕中蛋白酶酶活模型的二次多元回归方程：Y=843.536 667-46.692 500X1+55.285X2+100.837 5X3+53.938 333X4-97.115X12+11.25X2X1-19.128 75X22-7.725X3X1+6.122 5X3X2-33.787 5X32+0.257 5X4X1+5.532 5X4X2+4.615X4X3-40.961 25X42。

利用SAS软件处理系统对所得模型进行典型性分析，以求发酵豆粕蛋白酶活最大时的最佳发酵条件，经过分析发现：在X1=-0.171 586、X2=0.522 874、X3=0.743 436、X4=0.380 084时，发酵豆粕的蛋白酶活力理论值取最大值947.99 IU/g，经换算和考虑实际操作，最佳发酵条件为发酵温度30℃、层厚度1.75 cm、基质含水量44%及发酵时间44 h，此条件下发酵豆粕蛋白酶活力可达907.94 IU/g。

2.2 响应面交互作用分析(见图1)

图1反映了不同因素交互作用的影响，由图1可知，基质含水量对蛋白酶的产量影响最为显著，这是由于随含水量的增加，豆粕颗粒表面的水分活度随之增加，利于微生物的生长与代谢活动的发生；但是含水量过高，豆粕颗粒之间的孔隙将减小，降低了空气在固态培养基颗粒表面流动性，造成微生物生长与代谢活动缓慢。Delabona等[10]通过试验证实了这种观点，其发现豆粕基质在高含水量时，黑曲霉产生的内切葡聚糖酶活力随含水量的增加而减少。

图1中的等高线图反映了不同因素交互作用的显著性，等高线的形状越接近椭圆，则两因素间的交互作用越显著，由图可知，温度与基质层厚度的交互作用最显著，其次是温度与基质含水量。在固态发酵中，基质层厚度对温度的影响不可忽略，由于固态基质为多孔状，热传导率较低，导致微生物生长与代谢时产生的热量不能及时传递到环境中，导致基质内部温度梯度的产生[11]。而在固态发酵中温度引起基质水分的蒸发，微生物的生长与代谢活动发生在基质颗粒表面，其介于空气（气相）与基质颗粒（固相）之间，基质表面水分活度至关重要，基质颗粒表面的水分活度越大，越利于微生物生长，但温度越高，基质水分蒸发速率越快，导致基质水分活度迅速降低，抑制了微生物的生长及代谢活动的进行。

2.3 恒温发酵与变温发酵的影响（见图2）

图1 不同因素交互作用的响应面与等高线图

两种发酵模式发酵72 h后，所得的发酵豆粕颜色都为棕黄色，且散发着浓郁的酱香，表明所制备的样品性状正常，符合发酵豆粕的生产标准。由图2可知，相对于恒温发酵过程，变温发酵过程由于提高温度抑制了微生物的生长与代谢，发酵豆粕的蛋白含量在36 h后几乎不再变化，发酵72 h后蛋白含量为53.73%，比恒温发酵的（54.29%）低0.56%，而变温发酵过程中在48 h时提高了发酵温度，更有利于蛋白酶的酶解作用，因此酸溶蛋白含量在48 h后增加的更快，发酵72 h后，酸溶蛋白含量可达19.75%，比恒温发酵提高了6.45%。

图2 恒温发酵与变温发酵对发酵过程的影响

3 小结

目前，我国对富肽蛋白的生产研究多集中蛋白酶酶解大豆蛋白，其生产成本过高，不利于富肽饲料的工业化生产。本试验通过响应曲面法对固态发酵生产富肽蛋白的发酵过程进行优化，以确定变温发酵温度转变时的最佳产酶条件。结果表明：最佳产酶条件为发酵温度30℃、层厚度1.75 cm、基质含水量44%及发酵时间44 h，方差分析结果表明回归模型的拟合程度良好，预测值和实际值之间的相关系数为0.951 5，由此可知，利用响应曲面法优化得到的最佳条件科学、合理。在此基础上，利用变温发酵制备富肽蛋白，结果表明变温发酵时微生物消耗的营养物质较少，而且可以产生更多的低分子肽类物质，发酵72 h后，变温发酵酸溶蛋白含量比恒温发酵提高了6.45%。这种发酵温度变换的策略为富肽蛋白的工业化生产提供了技术参考。