丁雯雯,王文华,孙立荣

(青岛大学医学院附属医院,山东青岛 266003 1 血液儿科; 2 药剂科)

藏红花素对骨髓造血干-祖细胞集落形成的影响

丁雯雯1,王文华2,孙立荣1

(青岛大学医学院附属医院,山东青岛 266003 1 血液儿科; 2 药剂科)

目的探讨藏红花素对骨髓造血干-祖细胞集落形成的影响。方法采用甲基纤维素半固体培养基对骨髓单个核细胞进行集落培养,分为空白对照组及浓度为0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 g/L藏红花素组,培养14 d进行集落计数。结果藏红花素浓度≤1.00 g/L时随藏红花素浓度增加集落计数增加,1.00 g/L时增加最显著;藏红花素浓度增加至2.00 g/L时集落计数减少,增加至4.00 g/L时不形成集落。结论适宜浓度的藏红花素(0.50～1.00 g/L)可提高骨髓造血干-祖细胞集落形成。

藏红花素;造血干细胞;细胞培养技术

过去20年中,大量植物来源的天然化合物被发现具有抗癌作用,中草药亦被越来越多地用于肿瘤病人的治疗中。藏红花是鸢尾科植物家族,自古以来就被民间医学广泛应用,其花柱头含有的藏红花素、花青素、胡萝卜素和番茄红素等,是已知的具有药理活性的成分[1]。研究结果显示,藏红花提取液可对多种肿瘤产生抑制作用,包括白血病、骨肉瘤、纤维肉瘤和卵巢癌等[2]。藏红花素的细胞保护作用则在近年来备受关注,已有研究结果表明,藏红花素具有很强的清除自由基的能力,其多种药学作用可能与此相关,包括改善乙醇引起的小鼠学习能力下降、降血脂、抗动脉粥样硬化等[3-6]。藏红花素可小幅度提高Dalton淋巴瘤移植小鼠的外周血中性粒细胞计数,其机制尚未阐明,而藏红花素在体外对骨髓造血干-祖细胞的影响尚未见报道。本研究旨在探讨藏红花素对骨髓造血干-祖细胞集落形成的影响,为藏红花素应用于肿瘤治疗提供理论基础。现将结果报告如下。

1 材料和方法

1.1 实验材料

藏红花素、甲基纤维素、牛血清清蛋白V均购自美国Sigma公司,胎牛血清(FBS)、IMDM购自美国Hyclone公司,SCF、IL-3、GM-CSF、G-CSF、EPO均购自美国Peprotech公司,2-巯基乙醇购自吉诺生物医药技术有限公司,马血清购自广州蕊特生物科技有限公司,Ficoll-Pague购自天津灏洋生物制品科技有限公司。

1.2 藏红花素溶液的配制

无菌条件下将1 g藏红花素溶于20 m L IMDM中,并加62.5 mg EDTA配成50 g/L溶液,4℃贮存。临用时用IMDM稀释为适当浓度。

1.3 骨髓单个核细胞(MNC)提取

骨髓标本来自本院血液儿科6例急性淋巴细胞白血病病儿(化疗后骨髓细胞形态学完全缓解、外周血中性粒细胞计数＞1.5×1012/L)。取胸骨骨髓0.5 m L,按下述操作提取MNC:①EDTA抗凝的骨髓按1∶2的比例与细胞缓冲液(含体积分数0.02 FBS的IMDM,下同)混匀;②在另外的离心管中加入分离液(Ficoll-Pague,比密度1.077),将等体积的骨髓细胞悬液沿管壁缓慢加至分离液面上,尽量保持界面清楚,20℃下2 000 r/min离心12 min;③取分离液和最上层IMDM液间的白色云雾层狭窄带750μL,加入4～5 m L细胞缓冲液中,1 500 r/min离心10 min,洗涤细胞2次,即得到单个核细胞;④1 m L IMDM培养液与单个核细胞制成细胞悬液,调节细胞密度至2×108/L。

1.4 集落培养

甲基纤维素半固体培养基含2-巯基乙醇1.45× 10－2mol/L,体积分数0.30马血清,体积分数0.01 BSA,EPO 1 k U/L,SCF 50μg/L,IL-3 50μg/L, GM-CSF 20μg/L,G-CSF 20μg/L,甲基纤维素9 g/L,青-链霉素105U/L。将MNC培养于24孔培养板中,分为空白对照组(A组)和0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 g/L藏红花组(B～G组),每组3个复孔,IMDM补齐至每孔0.5 m L,调整每孔细胞密度107/L,在37℃、体积分数0.05 CO2、饱和湿度条件下培养14 d后进行集落计数,取3个复孔平均值为该组集落数。

1.5 统计学处理

采用随机区组设计的方差分析对实验数据进行统计分析,组间两两比较采用LSD法,以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 藏红花素对造血干-祖细胞总集落形成影响

藏红花素浓度为4.00、8.00 g/L时无集落形成,故下文中省略该两组。藏红花素影响骨髓造血干-祖细胞总集落形成,D组的总集落数较其他各组均显著增加,E组较D组及C组均有显著下降(F＝37.3,P＜0.05),B组与A组比较,差异无显著意义(P＞0.05)。在藏红花素浓度≤1.00 g/L时,总集落形成数与藏红花素浓度呈正相关(r＝0.834,P＜0.01)。见表1。

2.2 藏红花素对红系集落形成的影响

藏红花素影响红系集落形成,以D组及E组红系集落形成的增加最明显(F＝6.6,P＜0.05),而D组与E组之间差异无显著性(P＞0.05)。在藏红花素浓度为0.25～2.00 g/L时,红系集落数与藏红花素浓度呈正相关(r＝0.690,P＜0.01)。见表1。

2.3 藏红花素对造血干-祖细胞总集落与红系集落形成的影响比较

藏红花素浓度≤1.00 g/L时总集落形成及红系集落形成均随浓度增加而增加,但红系集落所占百分比不足20%,至2.00 g/L时总集落数显著减少,而红系集落数无明显改变,红系集落所占百分比达到33.3%,高于其他组。见表1。

3 讨 论

藏红花素是一种新的抗肿瘤药物,许多实验证实藏红花素可增加细胞凋亡,抑制肿瘤细胞增殖。而近年来研究显示,藏红花素具有细胞保护作用,包括延长低氧小鼠的存活时间,保护低氧心肌细胞,抑制CCl4引起的肝损伤等[7-9],可能与藏红花素提高超氧化物歧化酶活性、清除细胞自由基有关,这与青紫薯色素、人参皂甙等中草药具有相似的作用[10-11]。HAMID等[12]研究显示,藏红花素能抑制Dalton淋巴瘤移植小鼠的肿瘤生长,同时不引起小鼠血红蛋白及中性粒细胞含量下降,且中性粒细胞百分数及绝对计数较正常对照组有小幅度升高。

本文结果显示,适宜浓度的藏红花素(0.25～1.00 g/L)可显著增强体外造血干-祖细胞集落形成,说明藏红花素对造血干-祖细胞具有保护作用,可在造血干-祖细胞水平干预外周血细胞成分。但是藏红花素浓度增至2.00 g/L时总集落形成显著下降,至4.00 g/L时没有集落形成。本课题组既往实验也显示,藏红花素在适宜浓度范围内显示细胞保护作用,高浓度则引起细胞坏死,提示高浓度的藏红花素具有细胞毒性作用。藏红花素对红系集落形成的影响主要体现在在2.00 g/L时总集落形成显著下降而红系集落形成不受影响,提示在高浓度藏红花素作用下,红系造血干-祖细胞更能耐受藏红花素的毒性作用。藏红花素对红系集落及非红系集落形成的影响具有浓度差异性。藏红花素浓度在≤1.00 g/L时非红系集落占到80%以上,且非红系集落的增加程度较红系集落高(54%∶36%),提示藏红花素在此浓度范围内以增加非红系集落形成为主,这可以解释藏红花素处理的Dalton淋巴瘤移植小鼠外周血中性粒细胞升高的现象。

藏红花素增加造血干-祖细胞集落形成的机制尚不明确。既往研究显示,藏红花素可以显著刺激γ-谷胱甘肽m RNA表达,通过增加谷胱甘肽合成来抑制神经鞘磷脂酶活性和神经酰胺合成,起到神经保护作用[13];通过抑制过氧化物酶、超氧化物歧化酶m RNA的表达降低氯化铍介导的氧化应激[14];抑制胶原引起的血小板内源性活性氧自由基及过氧化氢的产生[15]。此外,LI等[16]研究则显示,与藏红花素类似的一种中药提取物红景天苷,同样具有抗氧化作用,能激活细胞内聚ADP核糖聚酶1(一种细胞损伤修复中重要的酶),降低造血干细胞的氧化应激损伤。因此,我们推测,藏红花素提高造血干-祖细胞集落形成与其抗氧化应激作用有关。造血干-祖细胞在提取过程中产生氧化应激损伤,藏红花素通过上述抗氧化应激作用机制对造血干-祖细胞进行修复,减少造血干-祖细胞丢失。具体机制有待进一步研究。

本实验证实了藏红花素能增强体外造血干-祖细胞集落形成,这与传统的抗肿瘤药物明显不同,预示藏红花素具有更低的骨髓抑制作用,可以成为高效低毒的抗肿瘤药物,因而理论上讲是更理想的化疗药物,但其应用于临床尚需要更多的实验研究。

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(本文编辑 马伟平)

EFFECTS OF CROCIN ON COLONY-FORMING OF HEMATOPOIETIC PROGENITOR CELLS

DING Wenwen,WANG Wenhua,SUN Lirong(The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College,Qingdao 266003,China)

ObjectiveTo study the effects of crocin on the colony-forming of bone marrow hematopoietic progenitor cells (BMHPCs).MethodsBy using methylcellulose-based colony-forming assay,a colony culture was conducted for a single marrow cell,which was then divided into blank group and 0.25,0.50,1.00,2.00,4.00 and 8.00 g/L crocin group.Colony count was done after 14 day cultivation.ResultsWhen the crocin concentration was at≤1.00 g/L,the number of cell colony increased along with the increase of the concentration,the highest was noted at 1.00 g/L;the cell colony decreased when the crocin concentration up to 2.00 g/L,and no cell colony was formed when it reached 4.00 g/L.ConclusionSuitable concentration(0.50－1.00 g/L)of crocin can increase the formation of hematopoietic progenitor cells.

crocin;hematopoietic stem cells;cell culture ttechniques

R932

A

1008-0341(2013)04-0346-03

10.11712/qlyx201304021

2013-02-17;

2013-06-03

西藏自治区科委资助项目

丁雯雯(1986-),女,硕士研究生。

孙立荣(1961-),女,博士,主任医师,博士生导师。