曹 婷，张立岭，侯冠彧，周汉林，施力光，荀文娟

(1.中国热带农业科学院 热带作物品种资源研究所/农业部华南作物基因资源与种质创制重点实验室，海南 儋州 571737；2.海南大学 农业科学院，海南 海口 570228)

高通量测序技术主要分为：离子半导体测序、大规模平行签名测序、Illumina (Solexa) sequencing、454焦磷酸测序、ABI SOLiD sequencing、聚合酶克隆、DNA纳米球测序等。目前的高通量测序技术主要指454 Life Sciences公司、ABI公司和Illumina公司推出的第二代测序技术、单分子测序技术以及Ion Personal Genome Machine (PGMTM)新一代测序技术(第三代测序技术)[1-7]。高通量测序技术的出现，为更深入研究和探讨基因组或者目的基因的作用机制和功能带来了巨大的应用价值。

1 高通量测序技术发展现状

1.1 第二代测序技术(下一代高通量技术)

454 Life Sciences公司在2005年首次开发出了了第二代测序技术，根据酶级联化学发光反应原理研发出基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统[8]。接下来，Illumina公司和ABI公司相继推出Solexa[9-12]及SOLiD[13]测序技术。这些测序技术都是边合成边测序，即都是在合成链互补时加入被荧光标记的碱基获知加入的碱基被酶促级联反应催化底物激发出荧光，通过捕获被激发或者自身的光信号转化的峰值，获得序列信息。高通量测序技术操作简单，彻底脱离了传统测序技术中电泳的限制和束缚。与此同时，高通量分析也可以在芯片上进行。高通量测序技术可以一次同时测序和分析数以百万计的样品，这是传统的测序技术远不能及的，很大程度上节省了试验的时间和成本。

Roche/454测序技术读取长度(600～1 000 bp)，在3种测序技术中最长，可以对未知基因组进行从头测序，但其通量最低(0.5～1 Gb/run)。当遇到polymer(如AAAAAA等)时，碱基个数和荧光信号强度不成线性关系，即判断重复碱基有困难。

Illumina/Solexa属于高度自动化的系统，读取片段比其它种类的测序多，适合进行大量小片段的测序(如microRNA profiling)，其测序通量大，其新机型Hiseq 2000产出量为600 Gb/run，但基于可逆反应时随反应轮数增加效率降低、信号减弱，并且读长(通常为100 bp)比Roche/454短，给从头测序拼接带来困难。

ABI/SOLiD技术每个碱基读取2次，有非常高的准确性，特别是针对SNP的检测。此外，灵活的系统和完善的磁珠编码系统可以进行样品的pooling来分割测序区域，特别适用于具有高质量参考基因组序列物种的重测序，但是该测序读长(50 bp)最短，并且读取长度受反应轮数的限制，给从头测序拼接带来困难。

1.2 第三代测序技术(新一代测序技术)

随着第二代测序技术的不断完善和广泛应用，单分子实时测序技术(SMRT)开始发展起来[14]，该技术彻底脱离了在PCR扩增产物上捕捉信号的过程，达到了真正读取单分子荧光的能力[15]。该技术在DNA聚合过程中就能知道产物测序。SMRT技术在成本、测序速度和读取长度等方面都有着尤为突出的优势和潜力，对未来实现在短时间投入少量资金对测定动植物基因组的目标前进了一大步；但是该实验仪器设备价格昂贵，一般实验室难以支付。2010年底价格仅为普通测序仪的十分之一的PGMTM测序仪的出现解决了这个问题，它的设计原理是基于半导体芯片技术，将待测DNA序列固定在半导体芯片的微孔中，再依次加入碱基，检测不同碱基释放出的氢离子而读取出序列；其独特的流体系统、半导体技术和微体系的机械设计的结合可在2 h内获取10 Mb～1 Gb以上的高精度的序列，在高通量测序的发展路程中又有了很大的进步。

2 高通量测序技术的应用

随着高通量测序技术不断的发展，基因组研究进入了新的阶段，该技术已被广泛应用于在微生物和动植物基因组的研究。高通量测序技术除了用于大量的基因组序列分析外，还能用于基因表达水平的分析、RNA的鉴定、基因的筛选、DNA甲基化以及在医学、临床上的药物筛选、治病原理等研究。

2.1 高通量测序技术在全基因组中的应用

全基因组的测序的产生，使越来越多的物种基因组信息得到公布[16-17]，对更全面细致的了解一个物种的基因调控、物种进化、基因组成等方面有了重大意义。2008年，美国科学家首次利用高通量技术获得了人类全基因组[18]。2010年，中国研究人员参与大熊猫基因组测序，得到了世界第一个仅用高通量测序技术而来的基因组序列图[19]。

2.2 高通量RNA测序中的应用

最近，科学家利用高通量测序技术的结合，研发出RNA测序技术(RNA-Seq)，通过此技术可以检测基因的表达情况以及对差异基因进行筛选或分析。目前该技术已广泛应用于细菌、玉米、拟南芥、水稻、小麦和人类等生物的转录组测序[20-26]。

2.3 高通量测序技术在ChIP-Seq技术中的应用

ChIP-Seq技术(染色质免疫共沉淀技术，chromatin immunoprecipitation)在组蛋白特异性修饰位点或转录因子结合位点的研究中起着重要的作用，是研究蛋白与基因间的作用的工具[27]。最近研发的ChIP-Seq技术充分结合了高通量测序技术和ChIP的优势，更高效的研究目的蛋白的结合位点，该技术得到广泛使用并取得了突出的成果[28-32]。

2.4 高通量测序技术在DNA甲基化分析中的应用

DNA甲基化的功能主要体现在维持遗传印记作用、细胞的功能以及胚胎的发育等方面。高通量测序技术使该功能更加精确，结合高通量测序技术研发出的DNA甲基化技术有：甲基化DNA免疫共沉淀测序技术、甲基结合蛋白测序技术和亚硫酸氢盐测序技术[33-34]。现阶段，DNA甲基化利用高通量技术的研究已经广泛应用于水稻、拟南芥、蚕和人等[35-37]，并取得了显著的成果。

3 高通量测序技术在畜禽的研究进展

高通量技术为研究畜禽基因组、基因表达、基因调节机制、基因筛选、优良品种改进、兽药筛选、畜禽体内病毒致病机理和预防等方面取得了许多重要成果。以下简介高通量测序技术的应用实例。

2011年5月，李新建等[38]通过高通量测序技术、实时定量PCR技术、siRNA技术，沉默TCTP，研究探索翻译TCTP(控制肿瘤蛋白)对脂肪细胞分化中的作用和影响，对不同类型的瘦肉型猪和脂肪性猪的不同生长发育时期阶段进行脂肪组织和脂肪细胞中TCTP的表达规律研究；TCTP可能抑制脂肪的沉积，此发现为日后进一步研究探索肥胖关键基因调控机制提供科学依据。廉传江等[39]对猪的睾丸组织展开研究，以已知未成年及成年睾丸组织小RNAcDNA文库为前提，使用Solexa高通量测序技术，结合生物信息学分析来鉴定猪miRNA，并继续进行差异基因表达谱分析，同时预测并分析差异表达miRNA的靶基因及其相关功能，进一步分析代表性差异表达miRNA在发育过程中不同组织中的表达情况。研究结果表明：借助高通量测序技术中Solexa测序，成功得到成熟与未成熟睾丸组织小分子RNA序列14 802 526条，原始小RNA序列14 660 953条，其中大于18 nt小分子序列为12 738 518条，其中大于18 nt的原始小RNA序列12 660 584条，与其对应的unique序列分别为1 336 183条和2 053 109条；没有发育成熟的猪睾丸组织中，最多的小RNA序列为22 nt的，占总序列的32.54%；21～23 nt的占60%以上；在成熟的猪睾丸组织中，小RNA的长度在26～30 nt的序列丰度约67%，远大于占11.5%的21～23 nt序列。成熟与未成熟的猪睾丸的总小RNA在组成上有显著差异，且在成熟猪睾丸中的小RNA种类比未成熟的睾丸组织中丰富的多；通过利用生物信息学的分析，鉴定出了398个与猪已知同源保守的miRNA和138个新的猪候选miRNAs，其中有18个猪的新的特异性miRNAs；在成熟猪的睾丸miRNA序列的分析发现其miRNA的丰度及来源；以及和保守猪miRNAs的表达定量比较规律。并且通过10个miRNAs的荧光定量验证了Solexa测序分析的准确性等重要结果和信息，以上研究结果为日后研究人员对猪的miRNA在精子的生成过程的作用及形状表达等信息提供了理论依据。高其双等[40]通过高通量测序技术的帮助下，分析ST细胞生长受不同浓度肝素的影响，发现肝素的浓度在5～20 U/mL时会对ST细胞的增殖有促进作用，为日后猪瘟疫苗的研发和改善提供了参考。

何川等[41]研究人员对鸡胚的雌、雄性腺中基因转录表达谱进行了高通量测序分析，共获得了雌、雄基因有表达显著的有984个，miRNA43条。又通过该技术进一步发现有11个miRNA和3条信号通路可能参与鸡的性腺分化和发育作用。这些结果将为日后进一步对鸡的性别决定与分化相关的分子机制提供参考和依据。科学家针对家禽中的鸭也取得了一些成果，如鸭的遗传图谱的构建[42]；鸡与鸭的基因比较及定位[43]；全基因组的构建[44]；目的性克隆以及遗传多态性分析等等[45]。牛基因组的研究也在日益不断创新和深入，在物理图谱、遗传图谱、全基因组序列图以及转录组研究都得到了尤为突出的成就，为牛业事业发展奠定了重要的基础，并得到了广泛的应用[46]。此外，高通量测序技术在鹿茸的生物学领域也有了一定的应用，为鹿茸生长和发育机制有了一定的研究成果，同时也为提高鹿茸产量、药产品质量带来了利益[47-49]。

4 高通量测序技术发展前景

虽然高通量测序技术优势众多，但同时也有他的局限性，如虽然提供了快速的测序技术，但是后续大量数据分析却为研究人员增加了工作量[50]。一般的高通量测序技术不适合小规模的测序，而且成本又高，不是一般小型的实验室能承担得起的，因此，以前的传统测序技术还不能被完全取代[51]。但是随着高通量测序技术的不断发展和创新，有了更为先进的改善，科学家研发出了既经济又实惠的高通量测序技术--单分子测序，并且有了很好的应用和发展[2,52-56]，相信，随着高通量技术的应用和不断的进步，会有更加完善、更先进的高通量测序技术发展起来，为日后的研究作出更大、更杰出的贡献。

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