霍顺校

（平乡职教中心，河北 邢台 054000）

随着我国养殖业的不断发展，养殖规模不断扩大，畜禽的饲养密度高度集中，调动也越来越频繁。再加上多年来畜禽品种在选育上偏重生产性能的提高，忽视了动物机体抗病性能的保持与加强。结果养殖环境逐渐恶化，动物机体抗病力逐渐减弱，致使病害频繁发生。尤其是一些发病率高、死亡率高的流行病的爆发，经常会给局部地区的养殖业带来毁灭性打击。因此加强对病害防治技术的研究，已成为推动我国养殖业可持续发展的关键。近年来，应用分子生物学技术在防治最突出的畜禽疫病的方面取得了一定的成就。目前分子生物学技术在我国畜禽疫病防治中应用，主要在畜禽疫病诊断和新型畜禽疫苗研究两个方面。

1 分子生物学技术在畜禽疫病诊断中的应用

传统的畜禽疫病的诊断主要依据肉眼观察、症状判别、显微镜检查、微生物培养、表型分析、血清学分析、病理切片观察等方法。但是这些方法的诊断时程较长，而有些畜禽疫病的发展迅速，由于不能及时治疗给生产造成重大损失。而分子生物学技术在诊断畜禽疫病时，可以为微生物病原体的鉴定提供快捷、精确的方法。目前在我国畜禽疫病诊断中常用分子生物学技术主要有以下几种。

1.1 PCR 技术

PCR 技术是一项体外扩增DNA 的分子生物学新技术。与传统的检测技术如生物化学、细菌学病毒学和血清学方法相比，PCR 技术具有快速、敏感、简单、特异性强的优点。它在畜禽疫病诊断中主要用于那些培养困难的细菌和抗原性复杂的细菌检测鉴定。它可以通过从基因中筛选某菌的特异性杂交片段来鉴定细菌。张嘉宁等采用酚提取法和裂解法制备了沙门氏菌的PCR 模版和PCR 诊断试剂盒，检测结果的阳性率比培养法高，且整个过程仅需6～8h。[1]此外对于严格厌氧菌如结节双枝杆菌、分离困难的支原体等，运用PCR 技术也很容易检测，并且节约时间，灵敏度也高。谢芝勋等建立了检测鉴别火鸡支原体的PCR 技术，用该PCR 技术能检测出100fg 的火鸡支原体DNA 模版。[2]PCR 技术不仅可以用于细菌、支原体等微生物的检测，并且可以用于病毒的检测，尤其是那些难以进行培养和血清学检测的病毒。刘加波等用PCR 技术对鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV）进行了敏感试验，结果可以检测出10pg 的ILTV－DNA，表明该PCR 技术有很高的灵敏度。[3]

1.2 基因探针

基因探针又称核酸探针，是指能识别特异碱基序列的有标记的一段单链DNA 或RNA 分子，即一段与被测定的核苷酸序列互补的带有标记的单股核苷酸。在畜禽疫病诊断中具有快速、简便、敏感的特点。只要得到病原体的基因序列，就可以在实验室合成特异性十分准确的探针。近年来，随着寡核核苷酸合成快速发展，越来越多的各种病原体的序列已被测定，因而有可能从这些序列中，筛选出共同的保守序列，然后合成某种光谱特异探针供实际检测应用。张训海等选用马立克氏病病毒（MDV）GA株BamHI 基因文库中LDNA 片段，制成DIG-标记的MDV 核酸探针，分别对Ⅰ型MDV 强毒株（BJ-1株）和弱毒株（Md11/75c株）感染材料的核酸进行dotblot 杂交检测，结果显示均有阳性呈色反应。[4]王蕾等用地高辛标记禽呼肠孤病毒（ARV）SL 基因中编码σC 蛋白的基因片段作为核酸探针，在斑点分子杂交中可检测到1.6 pgARV 的RNA。试验结果表明研究建立的核酸探针检测方法灵敏度高、特异性强和操作简便，适于批量样品的检测。[5]

1.3 基因芯片

基因芯片又称DNA 微阵列芯片、DNA 微阵列、DNA 芯片，其技术雏形是Southern blot 技术，是建立在基因探针和杂交测序技术上的一种高效快速的核酸序列分析手段。它的制作方法是首先在固相支持无（通常是硅化玻璃）上原位合成寡核苷酸或直接将大量预先制备的DNA 探针以显微打印的方式有序的固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，将未互补结合反应的片段洗去，通过杂交信号的检测分析得到样品的遗传信息。基因芯片技术不仅可以在DNA 水平上寻找和检测与疾病相关的内源基因及外源基因，而且可以在RNA 水平上检测致病基因的异常表达，从而对某些疾病作出检测，对病原体的抗药性作出判断，具有高亲和性、高精确性、高灵敏性、操作简便、结果客观性强的优点。[6,7]朱来华等通过分子克隆技术获得马疱疹病毒1型(EHV1)、马动脉炎病毒 (EAV)、马流感病毒 (EIV)、马传染性贫血病毒(EIAV)和东部马脑脊髓炎病毒(EEEV)等5种病毒各一段高度保守的特异性基因片段，用芯片点样仪逐点分配到处理过的玻片上，制备成检测芯片。提取样品中的RNA，进行反转录和荧光标记后滴加到芯片上进行特异性杂交，对杂交结果进行扫描检测和计算机软件分析。结果显示，制备的基因芯片可同时检测和鉴别上述5种病毒，可检测到阳性杂交信号的最高稀释度为10-6的病毒液，约25个病毒DNA 拷贝，但其他病毒材料未见红色荧光信号，证明了制备的基因芯片的具有特异性。[8]

1.4 酶联免疫吸附试验（ELISA）

酶联免疫吸附法（ELISA）是固相吸附技术和免疫酶技术相结合的一种方法，是免疫学诊断中的一项新技术。ELISA 的基础是抗原或抗体的固相化以及抗原或抗体的酶标记。固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。[9，10]因其具有特异性高、敏感性强、稳定性好、易于检测、结果可靠等特点，应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫学诊断，也应用于分子抗原和抗体的测定，其应用范围日益扩大，逐渐成为检测技术的主流。王海震等建立了检测猪瘟血清抗体水平的间接ELISA 方法。对收集的约120头份血清样品进行检测,结果显示该方法因具有较高的特异性和灵敏度高,同时克服了以往检测猪瘟抗体水平所用抗原为完整的病毒粒子，猪瘟病毒不易培养，滴度低，难于纯化等缺点。[11]李海燕等建立了禽流感间接酶联免疫吸附试验诊断技术（rNP-ELISA）。经试验证明，rNP-ELISA 是检测A型禽流感病毒血清特异性抗体的一种特异、敏感、微量、快速、经济的血清学诊断技术。其并将成熟的禽流感间接ELISA 快速诊断技术试剂盒化，该试剂盒与进口禽流感间接ELISA诊断试剂盒对同样血清样品检测，符合率为100%。[12,13]张国中等使用传染性喉气管炎 (ILT)抗体检测ELISA 试剂盒对已知来源的自制阳性血清、免疫血清以及SPF 阴性血清进行了ILT 抗体检测,研究结果表明该试剂盒具有较好的敏感性、特异性和重复性,与琼脂凝胶免疫扩散试验方法（AGP）相比,ELISA方法具有更高的敏感性,AGP 大约只能检出相对于ELISA 方法78.6%的阳性样。[14]

1.5 免疫荧光试验

免疫荧光试验是预先将荧光素标记在抗体上，再与涂片、切片或细胞悬液中的抗原进行反应，借助荧光显微镜观察是否有荧光素的荧光，判断是否存在相应的抗原并确定其相应的位置。免疫荧光试验是目前国内外实验室诊断畜禽传染病的常用方法，结果直观、可靠。特别是在疫情初期必须查清病源，检疫及净化养殖场病原时，此种检测方法尤为重要。袁婧等以临床“高热综合征”病例中分离的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)HBR 变异株接种试验猪制备抗血清，采用硫酸铵盐析法提取血清中免疫球蛋白 (IgG)，并用异硫氰酸荧光素(FITC)对IgG 进行荧光标记，建立了一种直接免疫荧光诊断方法(FA)，对临床10个猪场送检的38份病料平均阳性检出率为63．2%(24/38)。与RT-PCR检测结果符合率为96．3%，对几种已知猪病毒抗原无交叉反应。表明该方法具有特异性强、敏感性和重复性好等特点，FA 为PRRS 的临床诊断提供了一种快速、便捷、敏感、特异的检测方法。[15]

1.6 胶体金快速诊断技术

胶体金快速诊断技术是在酶联免疫吸附试验、乳胶凝集试验、单克隆抗体技术、胶体金免疫技术和新材料技术基础上发展起来的一项新型体外诊断技术。其基本原理是：以微孔膜为固相载体，包被已知抗原或抗体，加入待测样本后，经微孔膜的渗滤作用或毛细管虹吸作用，使标本中的抗体或抗原与膜上包被的抗原或抗体结合，再通过胶体金标记物与之反应形成红色的可见结果。由于其快速、便捷、不需特殊设备、结果判断直观，近年来越来越受到人们的重视，其技术发展迅速，在生物医学领域特别是医学检验中得到了广泛应用。目前在兽医临床诊断中也研制了许多种检测试剂盒，李蓓蓓等采用胶体金同时标记新城疫单克隆抗体和禽流感单克隆抗体制备复合型胶体金免疫试纸条可同时检测两种病毒。试纸条检测新城疫病毒的灵敏度比血凝试验结果高8倍。[16]张书环等利用胶体金免疫层析技术原理，用原核诱导表达的牛分支杆菌抗原蛋白MPB83 和MPB70 分别作为胶体金标记抗原和检测线上的捕获抗原，制备牛结核抗体检测试纸条。并与细菌分离培养、结核菌素皮内变态反应(TST)和韩国试纸条比较。试纸条与牛分支杆菌分离培养的符合率为85%，与TST 的符合率为79.73%，与韩国试纸条的符合率为98.75%。[17]金颜辉等进行了应用胶体金免疫层析技术检测猪瘟抗体的研究，用胶体金标免疫层析技术检测30份标准阳性血清和18份标准阴性血清，结果检测阳性、阴性符合率100%。[18]这些试验结果表明胶体金免疫层析试纸条具有敏感、特异、简便、快速的特点。

2 分子生物学技术在新型畜禽疫苗研制中的应用

由于病原体的强毒株和变异毒株的出现，用传统疫苗接种难以起到很好的免疫保护作用，给养殖业造成巨大的经济损失。为了更准确地预防控制这些疫病，根据各种疫病流行特点和免疫机理研制出安全有效的新疫苗。随着分子生物技术的不断发展，以分子生物学技术为基础的一批新疫苗开始被研制出来并逐渐应用到实际生产中，这些以分子生物学为基础的新畜禽疫苗主要有以下几种。

2.1 重组亚单位疫苗

重组亚单位疫苗又称生物合成亚单位疫苗或基因工程亚单位疫苗，只含有病原体的一种或几种抗原,而不含有病原体的其他遗传信息。能利用体外表达系统(如大肠埃希氏菌、杆状病毒、酵母等)大量表达病毒的主要保护性抗原蛋白作为免疫原。在研制亚单位疫苗时,首先要明确编码具有免疫原活性的目的DNA 片段,将具有免疫原性的抗原决定簇的基因编码片段插入到合适的表达质粒中，并使其在病毒、细菌、酵母、昆虫细胞中高效稳定表达，以基因工程技术生产大量抗原，从而制备成只含免疫原性的亚单位疫苗。该类疫苗不含致病因子的核酸成分，因此具有良好的安全性,且便于规模化生产。姬向波等构建了编码鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV）主要抗原gB 基因的重组DNA 疫苗pcDNA-gB，将其与他们保存的重组鸡痘病毒rFPV-gB-gD-IgY 分别以单独和混合的方式给4周龄非免疫鸡进行免疫，然后测定ILTV 特异性抗体和T 淋巴细胞增殖反应。结果表明这2种基因工程疫苗均能诱导鸡产生特异性的体液免疫及细胞免疫应答，该研究结果为ILTV 新型疫苗的研究奠定了基础。[19]付玉洁等采用猪圆环病毒PCV2a-LG株和PCV2b．YJ株制备了2种病毒灭活疫苗，及其重组杆状病毒表达的2种Cap 蛋白(PCV2a-rCap 和PCV2b-rCap)亚单位疫苗。选用8周龄BALB/c 鼠165只，随机分成11 组，每组15只，用上述4种疫苗各免疫2 组，以PCV2a或PCV2b株攻毒。攻毒后，采用免疫过氧化物酶单层细胞试验方法。检测抗体，其中PCV2a．rCap 免疫组抗体效价最高。[20]

2.2 合成肽疫苗

合成肽疫苗(Synthetical peptide vaccine)也称表位疫苗(Epitope vaccine),应用计算机软件分析和生物信息学技术，从蛋白的一级结构结合单克隆抗体分析等技术可以推导出该蛋白的主要表位，并用化学方法合成这一类似于抗原决定簇的多肽（20～40个氨基酸）作为抗原。合成肽疫苗分子是由多个B细胞抗原表位和T 细胞抗原表位共同组成的,大多需与一个载体骨架分子相耦联。它们的特点是纯度高、稳定。由于它只能线性表达，不能折叠，因此只适应于线性病毒病。合成肽疫苗的研究最早始于口蹄疫病毒(FMDV)合成肽疫苗,主要集中在FMDV 的单独B 细胞抗原表位或与T 细胞抗原表位结合而制备的合成肽疫苗研究。赵凯等以猪自体免疫球蛋白IgG的H 链作为外源抗原载体制备合成口蹄疫肽疫苗，对豚鼠、猪等起到了保护作用。[21]刘明秋等根据A型口蹄疫病毒(FMDv)的VP1 基因序列及国际上公认的抗病毒中和表位，并结合对151 蹄疫病毒的研究成果，设计了A型FMDV 的重组多肽疫苗,体外免疫原性检测表明，该融和蛋白具有免疫反应性,免疫豚鼠的实验结果表明，融合蛋白能在豚鼠体内诱导中和抗体，并使70%的豚鼠能抵抗病毒的攻击。[22]

2.3 基因缺失疫苗

病毒编码毒力的基因可以删除，当某些与病毒复制无关的毒力基因缺失突变后，病毒毒力丧失或明显减弱，但病毒复制能力并不丧失，同时还保持着良好的免疫原性。基因缺失疫苗是利用重组技术敲除表达毒力因子的特异基因获得的基因缺失弱毒疫苗株，病原性与致病力减弱，降低了对宿主组织侵害。其突出的优点是疫苗毒力不会返强而免疫原性不发生变化，免疫期长等，因而是较理想的疫苗。何启盖等用鸡胚成纤维细胞扩大培养了PrV HB－98 突变株(TK－/gG－/LacZ＋),研制了伪狂犬病基因缺失疫苗,并对该疫苗经肌肉接种、经口等免疫途径的最小免疫剂量进行了测定,田间试验表明,4 批猪伪狂犬病基因缺失疫苗安全有效,并可用于仔猪发病时的紧急接种。为猪伪狂犬病基因工程疫苗的制备与应用提供了有力的依据。[23]康凯等通过基因同源重组技术，利用高效自杀性载体系统，敲除鸡白痢沙门氏菌 (S.pullorum)CVCC 79201株的rfaH 基因，同时未引入任何抗生素抗性基因等外源DNA序列，经筛选获得重组S.pullorum(rSp)株。动物试验结果表明，rSp 免疫伊莎褐蛋鸡后，其抗血清可通过平板凝集试验与CVCC 79201 免疫的血清相区分，为S.pullorum 缺失疫苗的研制提供了技术平台。[24]

2.4 重组活载体疫苗

重组活载体疫苗是以病毒或细菌为载体通过基因工程的方法使之表达某种特定病原物的抗原决定簇基因,从而产生免疫原性。也可以是致病性微生物通过基因工程的方法修饰或去掉毒性基因,但仍保持免疫原性。制成的重组活载体疫苗可同时启动机体细胞免疫和体液免疫，克服了亚单位疫苗和灭活疫苗的不足，同时也不存在毒力返强的问题。另一最大优点是活载体疫苗可以同时表达多种抗原，制成多价或多联疫苗，既解决了现有多联疫苗的制造工艺难题，又能一针防多病。贾立军等以鹅源H5亚型禽流感病毒（AVI）基因组为模板，用RT－PCR 扩增血凝素（hemagglutinin）基因，克隆入鸡痘病毒表达载体Pfg1175，转染鸡痘病毒感染的鸡胚成纤维细胞，通过蓝斑筛选和间接免疫荧光检测，获得表达HA 基因的重组鸡痘病毒,免疫试验结果表明，构建了表达HA 基因的重组鸡痘病毒，该重组病毒具有良好遗传稳定性，免疫鸡可提供完全保护，显示出了一定的应用前景。[25]马呜潇等成功的筛选到了一株携有了口蹄疫病毒（FMDV）多表位基因的重组鸡痘病毒rFPV－OAAT－IL18。通过RT－PCR 和IFA 检测表明，相应的目的基因在重组病毒中获得了表达，这为新型FMDV 疫苗研究提供了新思路。[26]

2.5 转基因植物疫苗

转基因植物疫苗是利用分子生物学技术,将病原微生物的抗原编码基因导入植物,并在植物中表达出活性蛋白,人或动物食用含有该种抗原的转基因植物,激发肠道免疫系统,从而产生对病毒、寄生虫等病原菌的免疫能力。转基因植物疫苗实际上是重组DNA 疫苗的一种，但是由于生产疫苗的系统由大肠杆菌和酵母菌换成了高等植物，有的植物是可以生食的，例如黄瓜、胡萝卜和番茄等，有的植物可以作为饲料，如玉米、大豆等，合适的抗原基因只要在该植物可食用部位的器官特异表达的启动子的驱动下，经转化得到的转基因植物即可直接用于畜禽的口服免疫。转基因的植物疫苗具有效果好、成本低、易于保存和免疫接种方便等优点。潘丽等构建克隆有O型口蹄疫病毒China99株VP1 基因的植物双元表达载体pBin438/VP1。通过农杆菌介导法把口蹄疫病毒VP1 基因整合到番茄基因组获得转基因番茄，三次免疫豚鼠后21d 血清效价最高可达1∶64，攻毒后两组免疫豚鼠保护率分别达80%和40%，证明转基因番茄表达的VP1 蛋白具有良好的免疫原性。[27]余云舟等在构建口蹄疫病毒（FMDV）结构蛋白P1 基因植物双元表达载体的基础上，用农杆菌介导法和基因枪轰击法转化玉米共获得了13株转基因玉米植株，为利用植物生物反应器生产FMDV 基因工程疫苗进行了探索性基础研究。[28]王炜等以豆科牧草百脉根为转化受体，将口蹄疫病毒P12A－3C 基因通过农杆菌介导法导入百脉根基因组。对转基因植株进行PCR、RT－PCR 检测，表明口蹄疫病毒P12A－3C 基因整合在植物染色体基因组，并且具有转录活性，ELISA 检测表明，转基因植株能够表达出口蹄疫病毒P12A－3C 基因的目的蛋白。[29]

2.6 核酸疫苗

核酸疫苗也称基因疫苗或DNA 疫苗，是随着基因治疗而发展起来的第三代疫苗。它是将外源病原的一种或多种保护性抗原基因与细菌的DNA 或病毒的DNA 连接后直接导入动物体内，在机体内表达相应抗原，诱导机体免疫系统产生对相应抗原的免疫保护作用。核酸疫苗有许多优点，如：制造简便、生产速度快、成本低、容易控制质量、免疫期长、热稳定性好、便于贮藏和运输，能同时刺激B 细胞产生体液免疫、刺激T 细胞产生细胞，无感染因子等。张丹等成功构建了重组质粒pV ·H5 ·H7,试验证明它在体外可有效进行共表达,具有良好的免疫原性。免疫小鼠后,可诱导小鼠产生较高水平的体液免疫和细胞免疫应答,与单独表达H5HA 和H7HA1 的重组质粒产生的应答指标差异不显著(P＞0.05),免疫组均显著高于对照组(P＜0.05),结果表明,重组质粒pV ·H5 ·H7 具有较高的表达水平。[30]沈国顺等将猪繁殖与呼吸综合征病毒的ORF5、ORF3 基因插入真核表达载体pVAX1、pVIR－IL－l8的CMV 启动子下游,构建成真核表达质粒pVAX1－ORF5－ORF3 和 pVIR－IL－l8－ORF5－ORF3, 进行BALB/c 小鼠免疫试验,检测出 pVIR－IL－l8－ORF5－ORF3 免疫组的小鼠的ELISA 抗体水平高于pVAX1－ORF5－ORF3 和 PRRS 灭活苗免疫组,CD8＋T 淋巴细胞亚群数量显著高于pVAX1－ORF5－ORF3 和PRRS 灭活苗组,表明IL－18 核酸疫苗对猪的细胞免疫功能具有明显的促进作用。[31]

3 结语

分子生物学技术在畜禽疫病防治中的应用,为畜禽养殖业的发展带来了革命性的变化。快速准确的病原体检测手段,高效免疫疫苗的制备都在很大程度上缓解了病害所带来的严重损失。然而分子生物学技术也不是完美的,各种方法都还或多或少存在一些缺点,如PCR 扩增偏嗜性、嵌合现象,以及提取的微生物总DNA 不具代表性，并且目前的分子实验主要是应用于基础性的研究,分子生物学技术要真正的应用于生产,还有待于优化检测条件,简化仪器设备以及降低昂贵的实验成本。近几年来,我国在畜禽疫病防治上取得了一定程度的进展,但要进一步深入地解决病害问题,重点还应该放在免疫防护、病害的预测和预报以及健康养殖模式的建立上。目前我国的畜禽养殖业得到了政府极大的重视,资金投入力度不断加大,相信将会有越来越多的更高水平的分子生物学技术投入到畜禽疫病防治研究中去,从而进一步推动我国畜禽养殖业取得更大的发展和进步。

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