鲁 珊， 黄健花， 王兴国

（江南大学 食品学院，江苏 无锡214122）

甘二酯，也称为脂肪酸甘油二酯（DAG），是由丙三醇（甘油）与两个脂肪酸酯化得到的产物，按空间异构分为 1，3-甘二酯（1，3-DAG）和 1，2-甘二酯（1，2-DAG）。其中，天然食用油脂中的甘二酯以1，3-DAG为主，占甘二酯总量的70%左右。1，3-DAG具有很好的乳化性能，可作为乳化剂广泛应用于食品、药品和化妆品等行业；另一方面还具有许多生理功能，可用于预防与治疗高脂血症及与高脂血症密切相关的心脑血管疾病，近年来受到人们的广泛关注[1-3]。

目前合成1，3-DAG主要有化学法和酶法。化学法得到高纯度的产品比较困难，往往需要多步骤的反应以及繁琐的纯化操作[4]。酶法反应条件温和，且由于酶的选择性，较易得到高纯度的1，3-DAG。角田昭等人研究了在脱水条件下利用碱性脂肪酶进行的酯化反应，反应48h酯化率达到96%，甘油二酯质量分数为60%[5]。Masakatsu[6]等人利用固定化脂肪酶作为催化剂进行酯化反应，酯化率能达到86%左右，甘油二酯质量分数可达65%，但是反应是使用的是非特异性脂肪酶，所以得到的DAG是1，3-DAG和1，2-DAG的混合物。邱寿宽等人用Lipozyme RM IM做催化剂，以大豆和甘油为底物，在最适条件下，甘二酯得率为51.7%。

作者选用特异性酶Lipozyme RM IM做催化剂，以脂肪酸、甘油为原料直接酯化生成1，3-DAG，不仅反应方便，可一步完成，且产物纯度较高，反应时间较短，为进一步放大和商业化提供技术基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

Lipozyme RM IM（物理吸附大孔阴离子交换树脂）:诺维信生物技术有限公司产品；甘油（AR级）:国药化学试剂有限公司产品；油酸（AR级）:国药化学试剂有限公司产品。

Re-52型旋转蒸发器:上海亚荣生化仪器厂产品；集热式恒温磁力搅拌水浴锅:金坛市医疗仪器厂产品；Waters 1525高效液相色谱:美国Waters公司产品；TGL-16B离心机:上海安亭科学实验仪器厂产品。

1.2 试验方法

1.2.1 酯化方法 取16.14 g油酸，然后将油酸与甘油按一定摩尔比混合，于一定温度、80 r/min搅拌均匀，添加一定量的固定化酶于真空反应器（真空度0.07 MPa）或常压反应器反应一定时间。反应过程中，按一定时间间隔取样分析反应物组成。

1.2.2 酸值的测定 按GBT 5530-2005进行。

1.2.3 酯化率的计算

酯化率（%）=[（反应起始酸价-反应物的酸价）/反应起始酸价]×100%

1.2.4 甘油酯组成分析 酯化产物用正己烷萃取，加少量水离心收集油相，吹氮气除溶剂，HPLC分析。分析条件:Waters Spherisorb Silica色谱柱（2.0 mm×250 mm）；流动相 A:正己烷-异丙醇（体积比99∶1）；流动相 B:正己烷-异丙醇-乙酸（体积比 1∶1:0.01）进行梯度洗脱，柱温:35 ℃；进样量:5 μL；漂移管温度:75℃；流动相流量:0.5 mL/min。检测器:蒸发光散射检测器，面积归一化法定量。

2 结果与讨论

2.1 反应产物组成

甘油与油酸反应后的产物组分有TAG、FFA、1，3-DAG、1，2-DAG 和 MAG，如图 1 所示:

图1 反应产物的高效液相图Fig.1 HPLC chromatograms of reaction products

2.2 真空脱水对酯化率的影响

适宜的水分含量是维持酶活力所必须的。但当水分含量超过一定量后，脂肪酶的酯化活力会大大降低，而表现为较高的水解活力。在酶催化酯化反应过程中，会生成水，水的存在不利于平衡向酯化方向进行。因此，采用一定措施去除体系中过量的水使反应平衡向合成方向移动，不仅可以提高酶活，也可以增加酯化率。作者考察了常压及真空条件下进行的酯化反应的进程曲线。

图2 脱水对1，3-DAG质量分数和酯化率的影响Fig.2 Effect of water removal on 1，3-DAG yield and conversion rate

由图 2可知，在常压下，反应 2h，1，3-DAG含量和酯化率分别是48%和52%；在真空条件下，反应2h，1，3-DAG含量和酯化率分别为62%和78%。之所以有这样的差距，可能是因为甘油是极性分子，在常温常压条件下甘油和脂肪酸供体之间的相容性很差，当甘油和脂肪酸供体混合后与脂肪酶接触时，极性的甘油分子倾向于包裹在脂肪酶上而造成酶的催化效率降低[8]。由此可见，在酯化生产1，3-DAG反应中除去反应生成的水分是十分必要的。

2.3 底物摩尔比的影响

任何一种底物摩尔数的改变，都会影响体系的稳定性及产物的扩散速率与含量，从理论上脂肪酸与甘油的摩尔比例在化学计量比 （2∶1）会使1，3-DAG质量分数达到最佳。如果脂肪酸质量分数过高，则底物利用率不高；如果甘油质量分数过高，不仅使体系的黏度加大，不利于反应的进行，而且体系极性增加，甘油与脂肪酶易沉积在底部，难以与脂肪酸有效的混合，使反应速率降低[9-10]。

作者以1，3-DAG质量分数及酯化率为指标，研究了反应温度65℃，Lipozyme RM IM添加量6%（以底物总质量计），真空脱水（0.07MPa）的条件下，油酸、甘油的摩尔比对酯化合成1，3-DAG的影响，结果如图3所示。

图3 底物摩尔比对1，3-DAG质量分数和酯化率的影响Fig.3 Effect of the molar ratio on 1，3-DAG yield and conversion rate

由图3可知，1，3-DAG质量分数随着底物摩尔比（油酸与甘油的摩尔比）的增加而出现先上升后下降的趋势。在底物摩尔比为2∶1时，反应2 h，1，3-DAG得率最高，可达到62%，酯化率为78%。当油酸与甘油的摩尔比例大于2∶1而小于3∶1（理论上生成TAG的比例）时，1，3-DAG得率和酯化率都会下降，这可能是因为体系中更多的油酸会趋向于转化为TAG，所以造成DAG的得率下降，进而1，3-DAG得率会下降。因此，反应体系中底物摩尔比采用2∶1为宜。

2.4 酶量的影响

在油酸与甘油摩尔比为2∶1，反应温度为65℃， 真空脱水 （0.07 MPa），4%、6%、8%（底物总质量计）作为酶量研究的变量条件下，考察了加酶量对1，3-DAG质量分数和酯转化率的影响，结果见图4。

图4 酶量对1，3-DAG质量分数和酯化率的影响Fig.4 Effect of enzyme load on 1，3-DAG yield and conversion rate

由图4可知，当酶量从2%增加到6%时，反应到2h时，1，3-DAG质量分数从50%上升到62%；酯化率从52%上升到78%，当继续增加酶量到10%时，1，3-DAG的质量分数和酯化率都是呈下降趋势的，这可能是由于酶底物数量有限，达到饱和，并且固体脂肪酶量过大，反应体系流动性差，反应一定程度受阻[11]。同时发现，随着反应时间的增加，1，3-DAG含量呈下降趋势，而酯转化率呈上升趋势，当反应时间到4 h后，酯化率为94%后，基本保持不变，由此可见酯化率最高时，1，3-DAG含量并非最高，这可能是由于体系反应过程中的酰基转移产物中1，2-DAG和TAG含量增加存在所致，因此以后的研究中酶添加量采用6%为宜。

2.5 温度的影响

适宜的温度控制对酶催化反应是重要的。脂肪酶来源不同，最适温度也各不相同。一般而言温度升高，有利于酯化反应副产物水的脱除，加快反应速率，但温度过高，则会影响酶的空间结构和构象，从而降低酶活力。所以实验需控制适宜的反应温度。研究了不同的温度对反应产物中1，3-DAG含量及酯化率的影响。如图5所示。其他反应参数为:油酸与甘油底物摩尔比2∶1，Lipozyme RM IM添加量6%（以底物总质量计），真空脱水（0.07 MPa）。

由图5可知，随着温度的升高，1，3-DAG的含量和反应初速度都是增加的，当温度为65℃时，反应时间为2 h时，1，3-DAG的质量分数最高达到61%，酯化率为78%。当温度高于60℃时，1，3-DAG的质量分数和反应初速度则降低。这可能是由于反应温度升高时，物质在反应体系中的溶解度会有很大提高，体系黏度低，传质速率就快，进而反应速度快。然而，随着温度的进一步升高 （温度高于65℃），热力学平衡占据主导地位，酰基位移增加（1，2-DAG由4.1%上升至8.9%），使1，3-DAG质量分数下降[12]。另外可以看到，随着反应时间的增加，1，3-DAG的质量分数呈下降趋势，当5 h后趋于平衡，而酯化率则缓慢增加，当4 h后保持不变。综合考虑以上因素，选择65℃作为反应温度较佳。

图5 温度对1，3-DAG质量分数和酯化率的影响Fig.5 Effect of temperature on 1，3-DAG yield and conversion rate

3 结语

采用RM IM酶催化脂肪酸与甘油合成1，3-DAG，利用真空脱水，油酸与甘油的摩尔比为2∶1，温度为65℃，酶量为底物总质量的6%时，1，3-DAG得率最高为62%。

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