王海波，于红博 (.吉林医药学院附属医院检验科，吉林 吉林 303;.吉林市中心医院检验科，吉林 吉林 3000)

在检验工作中可观察到少数样本血清HBsAg和抗-HBs同时阳性的现象，给检验结果解释和临床诊断带来一定的困惑。本研究分析同时阳性样本中HBsAg和抗-HBs的体外特性。

1 材料、方法与结果

1.1 样本来源

在日常工作中，应用全自动免疫发光检测技术在血清HBsAg阳性样本中收集到1例抗-HBs阳性的血清样本;收集20例血清HBsAg阳性并且血清抗-HBs阴性的样本，每例样本血清用生理盐水调整HBsAg至相近浓度;收集20例血清HBsAg阴性并且血清抗-HBs、抗-HBe和抗-HBc阳性的样本，每例样本血清用生理盐水调整抗-HBs至相近浓度。

1.2 主要仪器与试剂

Multiskan MK3酶标仪(上海雷勃生物技术有限公司);Fluo Cycle型核酸扩增荧光检测仪(上海科华实验系统有限公司产品);化学发光仪(日本东曹AIA-1800ST)。

乙肝血清学标志物定量检测试剂盒(日本东曹);乙型肝炎病毒(HBV)基因分型检测试剂(上海科华生物工程股份有限公司产品);乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)确认试剂盒(中和试验法)(珠海丽珠试剂股份有限公司);HbsAg亚型检测试剂(上海科华生物工程股份有限公司产品)。

1.3 血清学标志物的测定

运用化学发光定量方法按仪器标准操作规程进行操作。进行HBV五项血清学标志物(HBsAg、抗-HBs、HBeAg、HBeAb、HBcAb)的定量检测。

1.4 血清学中和反应

实验样本各反应物浓度的配制:根据实验设计，用生理盐水调控双阳性样本的HBsAg浓度为4.5μg/L;双阳性样本的抗-HBs浓度利用原始浓度为50.60 IU/L;用生理盐水调控20例HBsAg单阳性样本的浓度为810μg/L左右;用生理盐水调控20例抗-HBs单阳性样本的浓度为640 IU/L左右。

双阳性样本中HBsAg的中和试验:参照［1］HBsAg与抗-HBs体外中和反应比例，在抗-HBs过量情况下，向已经编号的20支试管中各加入HBsAg已经调控为4.5μg/L左右的双阳性标本0.2 mL，向每个试管中分别加入0.2 mL上述抗-HBs单阳性的样本，充分混匀，37℃孵育，孵育过程中不时摇匀以进行HBsAg与抗-HBs体外中和反应。2 h后，测定每个试管中的中和物的HBsAg含量。记录定量结果。取1例HBsAg单阳性样本0.2 mL代替双阳性样本的HBsAg做对照组平行分析。记录各组结果。

双阳性样本中抗-HBs的中和试验:参照［1］HBsAg与抗-HBs体外中和反应比例，在HBsAg过量情况下，向已经编号的20支试管中各加入抗-HBs原始浓度的双阳性标本0.2 mL，向每个试管中分别加入0.2 mL上述已经调控为810μg/L左右浓度的HBsAg单阳性的样本，充分混匀，37℃孵育，孵育过程中不时摇匀以进行HBsAg与抗-HBs体外中和反应。2 h后，测定每个试管中的中和物的抗-HBs含量。记录定量结果。取1例抗-HBs单阳性样本0.2 mL代替双阳性样本的抗-HBs做对照组平行分析。记录各组结果。

1.5 测定样本的HBV基因型和HBsAg亚型

HBV基因型测:采用上海科华生物科技有限公司血清DNA抽提试剂盒，按上海科华生物科技有限公司血清DNA抽提试剂盒说明书进行，用浓缩裂解法提取血清HBV DNA。取2μL提取液为模板做PCR扩增，按照文献介绍型特异性引物分型法［2］，利用巢式PCR技术对提取的血清HBV DNA进行基因分型，记录各组测定结果。

HBsAg亚型的测定:外送上海生工生物工程技术有限公司测定。

1.6 判断标准

化学发光定量检测技术测定的血清学标志物按说明书判断阴阳性结果来设定正常参考范围，即:HBsAg大于0.06μg/L为阳性，抗-HBs大于6.5 IU/L为阳性;HBV基因分型根据HBV全基因核苷酸序列异源性≥8%或者S基因区核苷酸序列异源性≥4%将不同病毒株分为不同的基因型，迄今为止，HBV可以分为8个基因型，即A、B、C、D、E、F、G和H型。

1.7 结 果

从2 566例日常检测中，获取1例HBsAg和抗-HBs双阳性样本:HBsAg为130.21μg/L、抗-HBs为50.60 IU/L，HBV基因型为B型，HBsAg亚型为adw;获取20例HBsAg单阳性样本，HBsAg浓度大于800μg/L;获取20例抗-HBs单阳性伴随抗HBe和抗-HBc阳性样本，抗-HBs浓度大于600 IU/L。

双阳性样本中HBsAg的中和试验结果表明，20例不同来源的抗-HBs体外均能中和双阳性样本中的HBsAg;双阳性样本中抗-HBs的中和试验结果表明，20例不同来源的HBsAg单阳性样本中，有6例能中和双阳性样本中的抗-HBs(中和物抗-HBs浓度小于6.5 IU/L)。双阳性样本中HBsAg和抗-HBs的体外中和反应有显著性差异(P＜0.01)

2 讨论

HBV基因组全长3 215 bp，含有4个开放读码框架，分别为S、C、P和X区，S基因编码HBV前S1、前S2和主蛋白，病毒在肝脏实质细胞中产生的HBsAg不仅包被病毒基因组，更有过量表达的HBsAg释放到血液中。HBsAg具有较强的免疫原性，可诱导机体产生具有保护性作用的抗-HBs。

HBsAg和抗-HBs的中和反应是机体免疫乙肝病毒的基础。当HBsAg诱导机体产生抗-HBs时，在同一机体内环境下，两者会连续进行特异性中和反应，实验室检测离体血清学标志物发现，当HBsAg过量时，只能检出HBsAg，当抗-HBs大量产生时，体外只能检出抗-HBs。但在临床实践中，可观察到HBsAg/抗-HBs同时出现阳性的现象，多见于慢性HBV感染者。

本研究是经过长时间收集血清，最终获得1例慢性乙肝患者血清，化验复核后证实为HBsAg阳性，同时抗-HBs亦为阳性。抗-HBs均检测2次以上，并应用了不同厂家、不同检测生产的抗-HBs检测试剂盒核实无误。

抗-HBs产生有下列两方面的因素可以诱导:①接种乙肝疫苗后，获得了免疫力，是一种好现象;②乙肝恢复期或曾患乙肝已愈，表示已有免疫力。机体未接种过乙肝疫苗具有的抗-HBs是机体隐性感染乙肝病毒引起机体产生的抗体，属野生型抗体，具有型的特异性，此时机体内往往同时存在抗-HBe和抗-HBc。20例来自不同个体的野生型抗-HBs分别与本研究双阳性样本中的HBsAg反应体外全部完全中和。双阳性样本中的HBsAg是普通流行的野生型。

HBsAg有4种亚型(adr、adw、ayw、ayr)，有较明确的地理和民族分布特征，具有流行病学意义。据报道，我国主要存在adr、adw、和ayw三种亚型，北方以adr亚型为主，南方以adw亚型为主，新疆、西藏和内蒙古等少数民族居住地区以ayw亚型为主［3］。20例来自不同个体的野生型HBsAg分别与本研究双阳性样本中的抗-HBs反应，体外6例能完全中和(被中和)抗-HBs，14例无反应。双阳性样本中的抗-HBs只能与部分野生株HBsAg进行特异性中和反应。同时阳性样本中的抗-HBs不是与其共存的HBsAg的特异性抗体，在体内不发生特异性中和反应，体外血清学标志物检测呈同时阳性。

综上所述，HBsAg和抗-HBs同时阳性样本中，机体内HBsAg是普通流行的野生型HBsAg，抗-HBs与机体隐性感染产生的野生型抗-HBs在体外血清学中和反应的范围有显著性差异，该抗-HBs是针对某种HBV基因型的特异性有效保护性抗体，与机体本身携带的HBsAg无特异性关系。

［1］ 滕 龙.HBsAg与HBsAb中和比的研究及应用探讨［J］.医学研究通讯，2005(6):17-20.

［2］ Naito H，Hayashi S，Abe K.Rapid and specific genotyping system for hepatitis B virus corresponding to six major genotypes by PCR using type-specific primers［J］.J Clin Microbiol，2001，39(1):362-364.

［3］ 董 梅，张跃新.乙型肝炎病毒基因型分布及临床意义［J］.中华肝脏病杂志，2005，13(1):56-57.