邓凯波，霍贵成*

(东北农业大学 乳品科学教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150030)

自古以来，乳酸菌就是人们广泛使用的一类益生菌。现代工业中，益生菌发酵制品种类繁多，很多乳酸菌被用作发酵剂应用于工业生产，其中嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)为应用最广泛的乳酸菌之一。然而，由于噬菌体污染而导致的生产失败已造成了重大的经济损失。尽管研究者们已采取了许多手段[1]，但收效甚微。

规律成簇的间隔回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)以“重复序列-间隔区(repeat-spacer)”为单元组成了原核生物基因组上的一段非编码区，是专门针对噬菌体及质粒等外源基因的获得性免疫系统[2-4]。CRISPR序列的典型结构为21～48bp的重复序列和其间插入的相似长度的非重复间隔序列组成[2]。目前，嗜热链球菌CRISPR序列结构和作用机理方面的研究仅在Streptococcus thermophilusDGCC 7710中最为详尽[5-9]，我国尚无相关报导。探明我国嗜热链球菌中的CRISPR序列结构，对其进化研究以及今后噬菌体抗性突变菌株的构建都具有重大意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

8株嗜热链球菌(S.thermophilus)S0、S4、S06、S07、S14、S18、St和SM由KLDS-DICC保藏；E.coliDH5α为实验室保存。pMD18-T载体、限制性内切酶EcoRI、PCR体系中的GC bufferⅠ、LA Taq扩增酶 日本TaKaRa公司；细菌基因组提取试剂盒、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒 天根生化科技(北京)有限公司。

GM17培养基：蛋白胨5.0g、酵母提取物5.0g、胰蛋白胨5.0g、抗坏血酸0.5g、牛肉浸膏2.5g、β-甘油磷酸二钠19g、琼脂15g，1.0mol/L MgSO4·7H2O 1.0mL，蒸馏水定容至1L，118℃灭菌20min。固体GM17培养基另添加质量分数为1.5%的琼脂。

LB培养基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，用蒸馏水定容至1L，调至pH 7.0，118℃条件下灭菌20min。固体LB培养基另添加1.5%的琼脂。……