李 韬 赵金伟 葛巨刚 李晨玉 (吉林大学白求恩医学院，吉林 长春 300)

循环肿瘤细胞(CSC)是指自发或因医疗操作等人为因素进入外周血循环的肿瘤细胞。具有高度转移潜能的肿瘤细胞在循环系统中生存下来，相互聚集形成微小癌栓，并在一定条件下发展成转移灶，因此，检测外周血中肿瘤细胞可以预警肿瘤转移的发生。本研究采用RT-PCR技术分析外周血基因标记物mRNA表达与癌性肠梗阻肝转移的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料 收集吉林省人民医院及吉林省肿瘤医院2009年3月至2010年5月经X线和(或)腹部CT确诊的27例结肠梗阻病例，年龄68～82〔平均(75.3±6.7)〕岁，均经手术治疗，术中及术后确立诊断。20例为结直肠癌所致肠梗阻，7例为非癌性肠梗阻，20例癌性肠梗阻中有14例伴发肝脏转移。抽取静脉血5～10 ml放置于-80℃冰箱冰冻保存，备用。

1.2 外周血标本的预处理 外周血单个核细胞(PBMC)采用聚蔗糖-泛影葡胺梯度离心法，分离吸出白膜状界面细胞层，依次洗涤，离心后获得PBMC，置于-80℃冰箱中保存。

1.3 总RNA提取 用焦碳酸二乙酯(DEPC)严格处理实验器材以防RNA酶污染。解冻组织标本或粪便预处理后的标本，研磨后加入磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，1 000 r/min，5 min，弃上清;加1 ml Trizol，室温放置5 min，转到EP管加0.2 ml氯仿重悬沉淀，剧烈振摇，室温静置5 min;4℃12 000 r/min，离心15 min;上层水相移至另一EP管，加入0.5 ml冰异丙醇充分混匀，室温放置 10 min，4℃ 12 000 r/min，离心 15 min，去上清，加入75%冰乙醇-DEPC 1 ml，振摇洗涤沉淀，4℃ 12 000 r/min，离心10 min，弃上清;去乙醇，空气中干燥 RNA，加DEPC水10～50 μl，溶解RNA，所得的总RNA置于-80℃冰箱保存。

1.4 RNA纯度及完整性检测 取RNA样品用紫外-可见光分光光度计于260 nm、280 nm处测定A值，计算RNA浓度和RNA定量。取RNA样品进行甲醛变性，1%琼脂糖凝胶电泳，拍照，用光密度扫描仪扫描28 s和18 s条带，计算密度比值。

1.5 RT-PCR技术检测mRNA表达 实验所需引物及内参照β-肌动蛋白(β-actin)引物均系上海生工生物工程公司合成，经GenBank检索为特异性引物〔1〕。DNA Marker采用宝生物工程有限公司 DL2000 Marker。(1)逆转录:RNA 4 μl+OligodT 2 μl+DEPC 10 μl，72℃，5 min，变性模板 RNA，迅速放置冰上，复性模板 RNA。5倍缓冲液 5 μl+10 mmol/L dNTP 2 μl+25 U/μl Rnasin 1 μl+200 U/μl MMLV 1 μl，42℃，1 h，94℃，5 min，放于冰上，5 min，置-80℃储存。(2)PCR反应体系:灭菌去离子水 32 μl，10 × PCR 缓冲液 5 μl，10 mmol/L dNTP 1 μl，10 pmol 上游 引物 1 μl，10 pmol 下游 引物 1 μl，cDNA(0.1 μg/μl)1 μl，Taq DNA 聚合酶(2 U/μl)0.2 μl。扩增条件:β-actin:取 cDNA 2 μl，加入 10 倍缓冲液 2 μl，25 mmol/L 氯化镁溶液 1.2 μl，Taq 酶1 U，22.5 mmol/L dNTPs 0.16 μl，β-actin引物0.1 μg，加去离子水至20 μl进行PCP扩增。每次设一管不加样品 cDNA为阴性对照。反应条件为94℃预变性5 min，94℃变性 30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，共 30 个循环，72℃延长7 min。基因扩增产物经2%琼脂糖凝胶(含0.1%溴乙啶)电泳，拍照。环氧合酶2(COX-2)，肌酸激酶(CK-20)及CD44v6:逆转录产物2 μl，加入10 × PCR 缓冲液3 μl，COX-2 引物 20 pmol，β-actin 引物 4 pmol，Taq DNA 酶1 U，DEPC处理水至30 μl。反应条件为95℃预变性2 min，95℃变性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，共45个循环。基因扩增产物经2%琼脂糖凝胶(含0.1%溴乙啶)电泳，拍照。图片中出现相应大小的条带为mRNA表达阳性。

1.6 统计学方法 应用SPSS10.0软件行χ2检验。

2 结果

伴肝转移的14例病人中，85.7%(12/14)的病人外周血中至少有一种基因mRNA表达阳性;而在非转移的6例病人中，16.7%(1/6)阳性表达，差异有统计学意义(P=0.003 0)。

联合检测外周血中COX-2，CK-20及CD44v6 mRNA表达预测肝转移的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值及准确性分别为85.7%，83.3%，92.3%，71.4%、85.0%。

3 讨论

由于机体免疫系统的识别和机械性杀伤作用和肿瘤细胞自身因素，大多数进入循环的肿瘤细胞发生凋亡，不能形成转移灶，这种现象称之为“无效转移”〔2〕。只有极少数具有高度转移潜能的肿瘤细胞在循环系统中生存下来，相互聚集形成微小癌栓，并在一定条件下发展成转移灶。因此，检测外周血中肿瘤细胞可以预警肿瘤转移的发生。RT-PCR技术被认为是目前检测最有效的方法，以肿瘤和上皮组织中某些物质的mRNA为标记物检测结直肠癌CSC。Kopreski等〔3〕首次采用RT-PCR方法检测到黑色素瘤患者血浆中酪氨酸酶的mRNA，结果证实RT-PCR方法检测外周血CSC mRNA切实可行。采用RT-PCR及其他各种改进的RT-PCR技术，使用不同的标记物，可从105～107个循环细胞中检测出1个肿瘤细胞，常用的标记物有端粒酶 mRNA、CK mRNA、CD44v mRNA、EGFR mRNA 等，当以单一肿瘤标记物的mRNA为标记物，易受到假基因的干扰，造成假阳性的原因是组织特异性基因在非特异性基因细胞内的非法转录等，易导致假阴性的原因是循环肿瘤细胞间断释放入血以及RNA酶降解的特点。Hsieh等〔4〕对118例结直肠癌患者肿瘤组织和血清中K-ras、P53及APC基因突变采用PCR-SSCP方法进行检测，并对扩增的基因组DNA直接测序检查。Hibi等〔5〕对44例结直肠癌患者进行寡核苷酸错配检测，确定了血清中DNA的遗传变异特性，16例肿瘤组织及血标本中同样检测到了K-ras基因突变，在肿瘤组织内检测到P53基因突变的10例患者中，有7例患者血标本中也检测到了同样的基因突变，其中5例处于早期病变(P=0.01)，23%结直肠癌患者血清中P53或K-ras基因突变，结直肠癌早期患者血清出现高比例的P53基因突变提示其可以作为检测的标记物。Hardingham等〔6〕对结直肠癌患者采用PCR检测K-ras基因突变，发现K-ras 12位点突变与生存期和复发率相关，突变者生存率降低，复发率增加。由于DNA在循环中较为稳定，使用DNA检测得到的可能只是循环内的肿瘤负荷，而不是有活力的肿瘤细胞，近年来其应用逐渐减少，而以肿瘤或上皮组织特异性mRNA为检测对象的RT-PCR方法近年来应用最为广泛。Shen等〔7〕通过比较肿瘤及健康对照组的CSC检出率，发现良性肿瘤组及健康对照组CSC阳性率明显低于癌症组。在Dukes A、B期，Dukes C期及Dukes D期三组间CSC阳性率差异具有显著性，且CSC阳性率高的患者肝转移发生率高。Uen等〔8〕对行肿瘤根治性手术患者术前1 w和术后1 w外周血CSC进行检测，发现术后 UICC分期 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期患者阳性率分别为6.0%、30.3%和41.3%，而对应的术后复发率分别为2.3%、28.7%和39.7%，且CSC持续阳性提示患者术后生存期短。总之，在一般情况下，早期(Ⅰ、Ⅱ期)患者CSC阳性率较低，中晚期(Ⅲ、Ⅳ期)患者阳性率较高。RT-PCR检测方法与免疫组织化学法相比敏感度更高〔9〕，而且多项指标联合检测的阳性率明显高于单项指标，手术和化疗会使CSC计数减少，甚至转阴。

1 赵金伟，李 韬，马 震，等.大肠癌原发灶及粪便标本中基因mRNA表达及其临床意义〔J〕.中国实验诊断学，2012;16(8):1391-4.

2 Hunter K.Host genetics influence tumor metastasis〔J〕.Nat Rev Cancer，2006;6(2):141-6.

3 Kopreski MS，Benko FA，Kwak LW，et al.Detection of tumor messenger RNA in the serum of patients with malignant melanoma〔J〕.Clin Cancer Res，1999;5(8):1961-5.

4 Hsieh JS，Lin SR，Chang MY，et al.APC，K-ras and p53 gene mutations in colorectal cancer patients:correlation to clinicopathologic features and postoperative surveillance〔J〕.Am Surg，2005;71(4):336-43.

5 Hibi K，Dobinson CR，Booker S，et al.Molecular detection of genetic alterations in the serum of colorectal cancer patients〔J〕.Cancer Res，1998;58(7):1405-7.

6 Hardingham JE，Hewett PJ，Sage RE，et al.Molecular detection of bloodbone epithelial cells in colorectal cancer patients and in patients with benign bowel disease〔J〕.Int J Cancer，2000;89(1):8-13.

7 Shen C，Hu L，Xia I，et al.Quantitative real-time RT-PCR detection for survivin，CK20 and CEA in peripheral blood of colorectal cancer patients〔J〕.Jpn J Clin Oncol，2008;38(11):770-6.

8 Uen YH，Lu CY，Tsai HL，et al.Persistent presence of postoperative circulating tumor cells is a poor prognostic factor for patients with stageⅠ-Ⅲ colorectal cancer after curative resection〔J〕.Ann Surg Oncol，2008;15(8):2120-8.

9 Leather AJ，Gallegos NC，Kocian G，et al.Detection and enumeration of circulating tumour cells in colorectal cancer〔J〕.Br J Surg，1993;80(6):777-80.