李 阳潘 文徐宗香陈 曦刘 宇

（1黑龙江省兽医科学研究所，黑龙江齐齐哈尔 161006；2黑龙江省齐齐哈尔动物医院，黑龙江齐齐哈尔 161006）

猪繁殖与呼吸障碍综合征的研究进展

李 阳1潘 文2徐宗香1陈 曦1刘 宇1

（1黑龙江省兽医科学研究所，黑龙江齐齐哈尔 161006；2黑龙江省齐齐哈尔动物医院，黑龙江齐齐哈尔 161006）

猪繁殖与呼吸障碍综合征 （PRRS）俗称蓝耳病，是一种以母猪流产、死产、产木乃伊胎、弱仔和仔猪呼吸道症状为主要特征的传染病，死亡率很高。本文就近年来该病在遗传变异和病毒感染方面，尤其是免疫学研究的相关进展作一综述。

猪繁殖与呼吸障碍综合征；病毒感染；遗传变异；免疫学研究

猪繁殖与呼吸障碍综合征（PRRS）是一种猪的神秘综合征，由猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）引起，可导致妊娠母猪发生严重繁殖障碍，以及各年龄段猪（尤其是仔猪）的呼吸道疾病发病率和死亡率升高。1987年首次在美国暴发，1990年以后开始在欧洲一些国家传播。根据抗原性差异，PRRSV可分为北美洲型和欧洲型[1,2]。1996年，郭宝清等[3]首次证实PRRSV在我国猪群中存在，随后该病在我国呈蔓延趋势，流行毒株为北美洲型，我国将其列为二类动物疫病。该病目前已遍及全球，造成的经济损失占猪各类传染病总损失的30%以上[4]，对猪肉食品安全和市场供应构成严重威胁。美国农业部的年报称2000年至今，因PRRS造成的年均经济损失高达6.64亿美元。鉴于本病的危害性，本文拟对该病在遗传变异和病毒感染方面，尤其是免疫学的相关研究进展作一概述。

1 PRRSV的生物学特性

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒归属于套式病毒目的动脉炎病毒科、动脉炎病毒属。在电镜下观察，病毒粒子为直径48～83 nm，平均大小为60～65 nm的球形，核衣壳直径为25～30 nm，外包被一层脂质双层膜[5]。病毒粒子表面有明显的纤突，由于囊膜的存在，对温度、pH和去污剂较敏感。病毒感染性于-70℃下可稳定数月，4℃时7天感染性降到10%，21℃病毒可存活6天，随着温度升高，PRRSV可迅速失活。酸碱度也影响病毒活力，pH小于6或大于7.65时其感染性将失活。病毒在氯化铯中的浮密度为1.13～1.19 g/cm3，略低于在蔗糖中的浮密度，用氯化铯梯度离心提纯的病毒感染性高于蔗糖提纯法。PRRSV有着比较严格的生长宿主范围，在猪体内对单核巨噬细胞系统有嗜性，尤其是猪原代肺巨噬细胞（PAM），常用的原代和传代细胞中均不能生长；在体外，病毒可在MA-104及源于 MA-104的传代细胞系（Marc-145、CL2621和 CRL11171等）中增殖，但欧洲型在CL2621和Marc-145细胞系上却不易生长。高致病性PRRSV毒株在Marc-145细胞中适应1～3代即可产生明显的细胞病变。完整的PRRS病毒粒子没有血凝活性，不凝集羊、牛、猪、禽类和人的O型红细胞，但经非离子去垢剂和脂溶剂处理后，可凝集小鼠的红细胞[6-8]。

2 PRRSV的基因组结构

随着对多个PRRSV毒株全基因组序列测定的完成，病毒基因组结构得到完全解析。病毒基因组大小约为15kb，为一条单链、不分节段的正链RNA，有9个开放阅读框，分别为ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3～ORF7，每个阅读框编码特定的特异性蛋白。病毒基因组多数相邻的阅读框都有部分重叠，ORF1a编码起始区的核心序列为5'-UAACCAUG-3'， 高 度 保 守 ，ORF1a和ORF1b重叠16个核苷酸，共同组成ORF1，各编码一个多聚蛋白，占基因全长的80%，位于基因组5'端非编码前导序列之后。ORF1b的翻译是通过核糖体的滑动完成的。ORF1b含有四个独特区：①聚合酶元序列；②富含半胱氨酸和组氨酸的锌指区；③三磷酸腺苷结合位点或蜗牛酶基元序列；④功能不明的保守区域。ORF1a和ORF1b的表达产物为非结构蛋白。其余阅读框位于基因组3'端，是结构基因区。在ORF7终止密码子之后是3'端非编码区，含有poly(A)结构[9]，在该结构上游存在一个长约10 nt的转录调控序列，高度保守。对比高致病性蓝耳病的病毒基因组，发现与我国2005年以前分离的PRRSV相比，位于ORF1a的Nsp2基因中缺失了87个核苷酸，同源性仅为69.8%～86.2%。

3 PRRSV基因组的转录及表达

与其他正链RNA病毒一样，PRRSV基因组具有基因组复制和mRNA转录的双重功能。ORF1a与ORF1b直接由病毒基因组RNA表达。PRRSV基因组通过产生6个亚基因组mRNA表达，它们拥有共同的前导序列，位于病毒基因组5'端非编码区，长度超过200个碱基。各亚基因组RNA的3'端相同，形成对应mRNA2～7有共同3'端的亚基因组mRNA，从而形成一个嵌套式结构。这种基因表达模式与冠状病毒和凸隆病毒类似，且前导序列与mRNA序列间的连接区高度保守。有些PRRSV分离株产生7个亚基因组mRNA[10]，从ORF2～ORF7转录的mRNA分子之间多出一个亚基因组mRNA,试验证明这种差别与对肺的毒力和缺陷性干扰颗粒RNA无关。

4 病毒感染

PRRSV具有显著的单核细胞或巨噬细胞嗜性。病毒进入猪肺巨噬细胞有几个步骤：PRRSV病毒粒子黏附到巨噬细胞表白的硫酸乙酰肝素上；病毒经唾液酸残基与病毒包膜上的M/GP5蛋白结合物，与唾液酸黏附素形成更紧密结合物；在与唾液酸黏附素黏附以后，病毒和细胞受体复合物内吞形成笼形蛋白包裹的小泡。一旦内吞作用实现，病毒基因组会在内吞酸化作用下释放。病毒基因组释放还与CD163（清道夫蛋白）有关，同时病毒糖蛋白、GP2和GP4之间相互作用，这取决于功能CD163清道夫受体富含半胱氨酸结构域。另外，病毒入侵巨噬细胞的最后阶段需要一些蛋白酶参与。一旦病毒基因组在宿主细胞中释放，便开始转录和翻译形成新的病毒粒子。以上是PRRSV体外入侵巨噬细胞的过程[11]。

5 PRRSV免疫学研究

PRRSV的免疫学研究目前还是一项极具挑战性的课题。有关PRRSV感染的先天免疫的研究报道较少，有限的文献表明，机体针对PRRSV的天然免疫应答很弱，几乎没有IFN-a的应答，炎性细胞因子的产生是极少量的和延迟的，NK细胞的激活和增殖也不显著。PRRSV感染后可以产生强而快速的体液免疫反应，非中和抗体水平相对较高，在感染的早期就产生，而中和性抗体则要1～2月才产生。PRRSV的感染具有抗体依赖性增强作用，使得前期产生的抗体不能提供保护甚至是有害的。感染猪体液免疫产生的抗体主要是针对PRRSV的N蛋白、M蛋白和GP5蛋白。检测猪血清和口腔分泌物的试验中发现，血清中 IgM、IgA、IgG分别在预防免疫的第7天、第10天和第10天首次检测到，口腔分泌物中的IgM、IgA、IgG分别在免疫的第3～10天、7～10天和8～14天检测到[12]。PRRSV的特异性循环抗体可持续至少一年。另外，针对PRRSV非结构蛋白的抗体成分也可于感染后的1～4周检出。研究表明，PRRSV感染猪后能引起机体抗原特异性和剂量依赖性的细胞免疫反应。猪在人工感染和自然感染PRRSV的条件下，CD4+和CD8+T细胞的比率急剧下降。猪全身免疫应答分析表明，翻译方式和线粒体能量代谢的途径是相互联系的，以生物学功能为基础伴随翻译调节，包括蛋白质合成、RNA-post转录基因表达和细胞的生长、增殖等。研究表明，转录因子如MYCN、MYC、NFE2L2与免疫应答有潜在的关系。病原刺激机体产生特异性免疫，还与TREM 1、toll样受体、超细胞因子(hyper)和hyper趋化因子信号等有关。此外，还发现内源性和外源性免疫应答与抗炎反应调节有关。最值得注意的是，转录因子与HMGB1有潜在的联系，HMGB1是病毒核苷酸内部识别所必须的。其他转录因子像干扰素调节因子IRF1、IRF3、IRF5和IRF8也与PRRSV感染猪的特异性免疫有关[13]。

6 PRRSV的传播方式和流行病学特点

PRRS一年四季均可发病，不同品种、年龄、性别的猪均可感染，主要侵害繁殖母猪和仔猪。病毒可通过多种途径感染猪，且具有高度的感染性。群内水平传播是由于排毒、污染所至，病毒可通过病猪口腔、鼻腔、眼、腹腔和生殖道等传播。带毒母猪通过胎盘，带毒公猪通过精液在猪群内垂直传播给胚胎以及新生仔猪。引入外来带毒猪也能造成本病的传播和流行。同时，有人认为鸟类可能携带病毒，使得本病长距离传播。此外，空气传播是PRRS的一个重要传播途径，特别是短距离内。

PRRSV在猪体内可持续存在数月或更长时间，但并不一定表现明显症状，这种持续隐性感染是PRRSV流行病学的一个重要特点。病毒血症的持续存在，导致PRRS的循环传播，这是PRRSV持续感染的重要原因之一。初产母猪极易感染PRRSV，也是病毒在猪群中持续存在的另一因素。

7 遗传变异和疫苗研究

总结来自各国的PRRS流行病学调查发现，PRRSV在抗原性、毒力性和遗传性方面已经发生了变异。根据不同病毒的遗传学特性和抗原性质，目前将该病毒主要分为两个基因型：欧洲型（LV株为代表株）和美洲株（ATCC-VR2332株为代表株），两者核苷酸同源性仅为60%。为了更清楚地了解PRRSV各个分离株之间的进化关系，Meng[14]等从多个国家收集了66个PRRSV分离株，对它们的全基因序列进行比较分析，绘制遗传进化树。分析表明，在每个主要基因型内部，各个亚型之间的ORF5基因较为活跃，ORF7基因相对保守。整个结构基因的遗传进化树所显示的变异程度是最大的，欧洲株和美洲株是两个截然不同的基因型。分析来自中国大陆、中国台湾、危地马拉、日本和丹麦五个地区的分离株发现，其亲缘关系均与美洲毒株接近。分析中发现，3个丹麦分离株、中国分离株（S1）、加拿大分离株（PA8）、Nebraska分离株（E16244B）的遗传进化位置与弱毒疫苗病毒（MLV）—Resp PRRSV和VR2332的位置非常接近，可能由于丹麦许多猪场接种过VR2332弱毒疫苗,可见弱毒苗的使用对于PRRSV在猪群中持续感染具有重要意义。遗传变异性产生的机制目前尚不清楚。

目前对于PRRS还是以预防为主，疫苗主要是弱毒苗和灭活苗。弱毒疫苗诱导的免疫反应持续时间较长，许多国家都研制了针对该病的商品化疫苗，对于控制该病的传播和蔓延产生了积极作用。但是，免疫的同时也带来了负面作用，尤其是使用弱毒疫苗接种猪群后，可能导致病毒血症的发生，且对变异较大的病毒交叉免疫保护性低。有些商品疫苗只能保护猪群临床上不发病，但不能抵抗病毒的感染。更为可怕的是，一些弱毒疫苗毒株发生返祖现象[15,16]，造成PRRS再度暴发。使用灭活苗较为安全，但需要多次免疫，且免疫持续期短。PRRSV具有逃避或调控免疫系统的能力，以及病毒本身免疫应答的复杂性，使用一种疫苗很难根除疾病。要研发出有效、通用、安全和能区别免疫的疫苗对于科研工作者来说是一项严峻的挑战。近年来，人们逐渐开始研究活载体疫苗、亚单位疫苗和DNA疫苗等基因工程疫苗，已有将PRRSV GP5与猪伪狂犬病毒进行重组的研究。DNA疫苗以及可以作为核酸疫苗的候选基因也正在研制中。

8 结语

PRRSV可引起猪群多系统病症，并易继发细菌和多种病毒感染，使猪群死亡率增加，生长缓慢，增加饲养成本，生产性能下降。PRRS已遍及很多国家，2006年中国大规模暴发了高致病性PRRS，又名为蓝耳病或高热病。疾病蔓延至十多个省份，给养猪业带来惨重的经济损失。此后，2007年和2008年在其他亚洲国家，如越南、菲律宾，相继有暴发高致病性PRRS的报道。这些数据表明，PRRSV基因组存在高度变异性，因此对于疫苗的研究发展是一项挑战。同时，PRRSV在不断进化逃避猪抗病毒的免疫应答。一旦病毒感染机体组织，病毒本身的一些机制可以逃避猪的免疫系统，延缓保护性抗体的产生，在这种情况下，病毒便可以持续感染猪群，疫苗和药物往往无法达到应有的效果，更增加了治疗该病的难度。规模化养猪生产中当该疫病暴发时，配合使用高免血清与疫苗是紧急控制的有效措施之一，本研究室正在进行这项工作的研究。目前关于PRRSV分子生物学方面的研究进展迅速，研究侧重对免疫原性基因及致病基因的筛选、改造和利用，相信随着研究的深入，控制和预防PRRS为期不远。

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