李海凤，曾红宇，许岗，杨兆勇



D-海因酶固定化的研究及展望

李海凤，曾红宇，许岗，杨兆勇

063000 唐山，河北联合大学基础医学院（李海凤）；410100 长沙，湖南福莱格生物技术有限公司（曾红宇、许岗）；100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院药物研究院（杨兆勇）

酶的固定化（enzyme immobilization）是将水溶性酶经物理或化学方法处理后，成为不溶于水但具有酶活性的一种衍生物，在催化反应中以固相状态作用于底物。固定化酶因具有载体与酶结合的可逆及重复性[1]、粗酶液与载体结合的直接性[2]以及因恰当的结合方式而产生的酶活性位点的充分暴露[3]等特质而在生物催化领域被广泛应用。

海因酶（hydantoinase，E.C.3.5.2.2）是一种重要的工业酶，根据其催化底物的不同光学活性，海因酶分为 D-型、L-型和 DL-型，其中 D-海因酶（二氢嘧啶酶）可选择性催化 5-单替代海因或二氢嘧啶的开环，形成 N-氨甲酰-D-氨基酸产物，进而经化学或酶促降解产生相应的 D-型氨基酸[4]。而 D-型氨基酸作为医药食品及化妆品领域的重要原料，被广泛用于半合成抗生素、肽类激素、拟除虫菊酯和农药的工业生产[4-5]。因此，利用 D-海因酶生产 D-型氨基酸已成为手性产物研究领域的热点。

D-海因酶大多是同型二聚体或四聚体，亚基分子量在 50~ 60 kD 之间，需要金属离子作为辅因子。酶的活性易被一些螯合剂抑制，如 8-羟基-喹啉-5-硫酸。目前该类酶主要通过大肠杆菌产生，但其以溶液或冻干粉形式存在时均不稳定，这在很大程度上限制了它们在工业生产中的应用[6]。

基于海因酶的研究现状，本文将以对 D-海因酶进行固定化的常用载体为主线对该酶的固定化方式及未来研发趋势作一概述。

1 D-海因酶的固定化方式

根据现有文献报道，固定 D-海因酶的载体主要有各类树脂及各类以网状交联为骨架的聚合物。树脂类主要有聚苯乙烯（PS）阴离子交换树脂、二乙基氨基乙基（DEAE）纤维素树脂、Eupergit C、Eupergit C250L及其氨基树脂、苯酚甲醛（PF）树脂；聚合物类则以聚乙烯醇（PVA）和聚苯胺（PANI）为代表。此外，也有课题组应用氨丙基玻璃珠（APG）和海藻酸钙为载体对 D-海因酶的固定化进行研究。

1.1 聚苯乙烯树脂

聚苯乙烯阴离子交换树脂对 D-海因酶的固定始见于 Jia 等[7]的报道，该种固定方式主要基于两者间通过戊二醛形成的共价键，是“共价结合固定化法”的典型代表。该种方法制备的固定化酶呈现良好的稳定性及重复使用性，但参与共价结合的氨基酸残基不应是酶催化活性所必需的，否则会造成固定后酶活力的完全丧失。另一类应用于 D-海因酶固定化的聚苯乙烯树脂为 D92[8]。该树脂来源广泛，价格低廉，以该载体进行的酶固定化制备与再生较为容易。经该载体固定化后的 D-海因酶的m为游离酶的 1.8 倍，与离体酶比较，固定化后的 D-海因酶的作用温度及适宜 pH 更宽，储存及操作稳定性大幅提高。

1.2 Eupergit C250L及其氨基化树脂

马哲等[9]和Ragnitz 等[10]以 Eupergit C250L及其氨基化树脂为载体进行了海因酶固定化研究。结果表明，基于 Eupergit C 系列固定化载体的固定化技术能够保证 D-海因酶较高的酶活回收率，其中利用 Eupergit C250L为固定化载体，酶活的回收率可达 87%，半衰期长达 2500 h，有较好的应用前景，但由于载体价格较为昂贵，该方法的大规模应用存在一定障碍。

1.3 二乙基氨基乙基（DEAE）纤维素树脂

二乙基氨基乙基纤维素树脂为一类通过交联的方法对 D-海因酶进行固定的载体，最初见于 Rai 和 Taneja 的报道[11]。交联法反应条件比较激烈，固定化的酶活回收率较低，但适当降低交联剂浓度和缩短反应时间有利于固定化酶比活力的提高。实验结果显示二乙基氨基乙基纤维素树脂对 D-海因酶的酶活再生和酶再生的比率分别为 80% 和 86%。

1.4 海藻酸钠

李全文等[12]应用纳米 Fe3O4协同海藻酸钠固定化桑叶多酚氧化酶，发现海藻酸钙和氯化钙的用量更少，包埋时间和交联时间更短，相应酶活回收率更高。而张佳宁等[13]以海藻酸钠-壳聚糖为载体制备固定化磷脂酶 A2，具有工艺简单、条件温和、操作简便，而且固定化酶稳固性较好。在20 世纪，Chevalier 等[14]已经用海藻酸钙来固定海因酶，现在可以对海藻酸钙载体进行改进后再用于海因酶的固定。

1.5 其他

以网状交联为骨架的高分子聚合物因其高耐热稳定性、耐酸碱、比表面积大以及不易被微生物侵袭等特质而在D-海因酶固定化载体领域备受青睐。Andrade 等[15]把聚苯胺作为海因酶固定化的载体时，固定化酶可以保持游离酶 80% 的酶活力，在 5 次循环反应后仍能保持 55% 的酶活。陈建波和孙婧[16]将海因酶产生菌 SHNU01 包埋固定到聚乙烯醇（PVA）中。包埋法一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基进行结合反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率高，但是必须巧妙设计反应条件，使之化学反应时不至于破坏酶的活性部位和活性中心。

此外，Arcuri 等[17-18]将来源于 Vigna angularis 的海因酶固定到氨丙基玻璃珠上，并对其性质进行了检测。Ragnitz 等[19]感兴趣的另一固定化介质是水溶的碳化二亚胺，可与 EAH 琼脂糖 4B 联用，实现以对 D-海因酶的高活力保持为前提的高效固定化。

2 生物固定化及应用前景

随着酶的固定化方案及现代分子生物学理论的发展、完善与学科的交叠。一项称为“生物固定化”的技术悄然兴起。

20 世纪末，Linder 和Teeri[20]发现纤维素结合结构域（cellulose-binding domains，CBDs）可以特异地结合纤维素。并且，连接纤维素结合结构域的纤维二糖水解酶的反应速率比单纯的纤维二糖水解酶的催化效率更高。依此，国内外很多研究团队尝试将待固定的酶通过连接区与 CBDs 连接，进行融合表达，然后通过 CBDs 与纤维素的结合完成融合蛋白的固定化，开创了“生物固定化”的先河。

后续的研究者，如Chern 和 Chao[21]还陆续鉴定出该酶的不同结合结构域可分别与自然界中除了纤维素以外的几丁质[22]、壳多糖[23]等结合，更为广泛的候选载体将大大拓展“生物固定化”这项新兴技术的应用潜能。

基于生物固定化酶所用的载体价廉易得、固定条件温和无污染、对酶的毒性甚微且能维持其待固定酶的高度选择性和良好的生物活性，我们对于该种固定化方式给予美好的期待，期望可以构建能够同时表达海因酶和 N-氨甲酰基水解酶的表达载体，同时用现代高新技术对载体进行修饰改性以及开发合成性能优良的智能载体并进行生物固定化，使实验室科研成果应用于工业生产。

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国家自然科学基金（81172965）；中央高校基本科研业务费专项基金（2012N09）

许岗，Email：wangpeng@hnflag.com；杨兆勇，Email：zhaoyongy@163.com

2013-01-28

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2013.02.013