凌今，凌人，黄彬彬，叶炜剑，丛维涛，金利泰



缺血再灌注损伤与细胞信号转导

凌今，凌人，黄彬彬，叶炜剑，丛维涛，金利泰

325035 温州医学院药学院蛋白质组学中心（凌今、黄彬彬、叶炜剑、丛维涛、金利泰）；321000 浙江金华广福医院病理科（凌人）；321000 浙江金华市人民医院药剂科（凌今）

短暂的缺血会对器官造成损伤，但是在恢复灌注后，损伤反而进一步加剧，这种现象称为缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury，IRI）。临床上涉及缺氧/复氧过程的手术都不可避免地会发生 IRI，比如重大器官的移植、冠脉搭桥、溶栓术等。IRI 一直是医学研究的热点，近年来研究发现，缺血再灌注（ischemia reperfusion，IR）时，钙超载、供能不足和氧自由基的大量产生等理化因素刺激细胞，诱发信号介导的细胞损伤、凋亡是造成 IRI 的一个重要原因。本文就 IRI 与信号通路的研究进展做简要综述。

1 缺血再灌注损伤

缺血时器官以无氧酵解方式呼吸供能，胞内累积大量乳酸，pH 下降。再灌注时，细胞为了恢复正常的 pH 水平，泵入 Na+以交换 H+，但 Na+过量引发了 Ca2+内流，迅速升高的 Ca2+造成细胞钙超载，最终导致死亡[1]。过量生产的活性氧（reactive oxygen species，ROS）在 IRI 的发生发展中起着至关重要的推动作用，即使在临床手术时应用抗氧剂，其损伤往往也难以有效遏制。缺血发生时，细胞降低代谢水平来适应供能供氧不足的情况，再灌注时，细胞代谢水平迅速恢复正常，但氧化供能短时间无法满足其需求，这也是造成细胞损伤的又一原因[2-3]。功能细胞是器官的关键组成，代谢非常活跃，因而易受到最致命的影响。功能细胞的大量死亡宏观表现为器官的功能障碍，暂时或永久性的功能障碍即缺血再灌注损伤。

2 细胞信号转导

生物体是由一群具有特殊结构与功能的细胞并由细胞膜组成的复杂有机体，其内的大分子、细胞器、细胞、组织和器官在空间上是相互隔离的，且大多数细胞不与外界环境直接接触，因此多细胞生物对外界的刺激（包括物理、化学、生物因素）需要细胞间复杂的信号转导系统通过级联系统传递，从而调控机体内功能各异细胞的新陈代谢和行为，以保证整体生命活动的正常进行。可以说，所有重要的生命现象都与细胞内信号转导有关。细胞信号转导通常是指细胞通过细胞表面受体接受外界信号，通过系统级联传递机制，将细胞外信号转导为胞内信号，最终引起细胞生理反应或诱导特定基因的表达，引起细胞的应答反应[4]。病理状态下，细胞的信号转导发生改变，其中一部分级联信号激活自身防御及代偿机制，提高机体对疾病的抗性；另一部分信号则诱发细胞代谢紊乱，介导细胞凋亡，促进疾病的发生发展。因此，探究疾病状态下信号转导变化，可以为临床治疗开辟一条崭新的道路。

3 缺血再灌注的病理生理学特点

在病理条件下，冠脉闭塞 15 ~ 20 s，糖酵解随即成为高能磷酸化供能的唯一方式。虽然短时间内可以维持心肌细胞的基础能量需求，但是当缺血时间延长至 60 ~ 90 min 时，提供 ATP 的无氧酵解过程基本停滞，细胞几无能量供应，梗死面积逐步扩大，心脏挛缩。

再灌注时，心脏的能量需求恢复，然而功能的恢复却相对滞后，缓慢地达到缺血前的状态，这个现象被称为心肌钝抑。钝抑的心肌往往消耗大，做功少，效率低下。这主要是因为在再灌注时脂肪酸氧化、糖酵解和丙酮酸氧化速率大幅升高。高速率的脂肪酸 β 氧化极大地抑制了葡萄糖氧化，致使葡萄糖氧化和糖酵解水平失衡。血浆内的高浓度游离脂肪酸可进一步抑制丙酮酸的氧化。如果糖酵解与葡萄糖氧化偶联，那么糖酵解不产生 H+。然而如果糖酵解不与葡萄糖氧化偶联，丙酮酸则酵解生成乳酸，这个过程中由于 ATP 的水解，每个葡萄糖分子净生成 2 个 H+。这种葡萄糖氧化和酵解的解耦合作用是心脏内 H+的主要来源。代偿供能产生的 H+蓄积于细胞内，再灌注时细胞会把 Na+泵入胞内，置换出 H+，从而恢复 pH 值到正常水平。Na+的大量流入刺激了细胞内的 Na+与细胞外的进行 Ca2+交换，Na+/Ca2+的交换效率很高，细胞内 Ca2+很快出现超载现象，最终导致了细胞的死亡[5]。

基于上述细胞代谢的研究发现，线粒体膜上非选择性的通道——线粒体通透性转换孔（mPTP）是再灌注损伤的决定性因素。再灌注期间，线粒体通透性决定了细胞存亡：如果通透性较小，细胞可能恢复；通透性中等，细胞发生凋亡；通透性极大，细胞则因为能量供应不足而坏死。在心肌缺血期间 mPTP 是关闭的，仅在再灌注的前几分钟开启，以适应线粒体钙超载、氧化应激、pH 的恢复以及 ATP 耗竭。这个通道的开放破坏了线粒体膜电位，阻断了氧化磷酸化，导致了 ATP 的耗竭，细胞最终死亡[6]。

此外，细胞内诸如 H+、Ca2+量的改变破坏了线粒体膜电位，导致了活性氧自由基的产生。活性氧会直接损伤 DNA、蛋白质、脂类，这种非特异性的损伤经过细胞因子介导，生成肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α。过表达的 TNF-α 与心肌细胞上的肿瘤坏死因子受体结合，引起心脏收缩功能障碍、心肌肥大、纤维化和细胞死亡。胞内过量的 Ca2+与焦磷酸形成复合物，同时产生尿酸，磷酸钙和尿酸被称为“危险信号”，都是强炎症刺激物。炎症刺激物包括现有炎性分子的增多以及白细胞介素-1β（interleukin 1β，IL-1β）的分泌等。这些炎性物质刺激Toll 样受体（TLRs）进而通过激活核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）促进炎性细胞因子和趋化因子产生。在再灌注的最初6 h，梗死区域内中性粒细胞趋化因子释放，并在未来 24 h 迁移到心肌组织。此过程促进中性粒细胞黏附，引起血管堵塞，并释放降解酶和更多的 ROS。正如上文所述，这些代谢变化又直接影响组织的炎症和完整性，甚至细胞的存活。

4 缺血再灌注损伤与信号通路

4.1 Toll 样受体 4 信号通路

Toll 样受体 4（Toll-like receptor 4，TLR-4）是 1997 年 Rock 等[7]首次发现的一种类果蝇源的 Toll 样受体，在人体内分布较为广泛。TLR-4 介导的信号通路包括髓样细胞分化因子 88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）依赖性途径和 MyD88 非依赖性途径。MyD88 依赖性途径是通过其与 TLR-4 相互作用，经 TIR 区域向细胞内传递信号，最终活化 NF-κB 进入细胞核，诱导一系列特定基因的表达，引起多种炎性细胞因子的释放，造成细胞损伤。

Wang 等[8]采用 BALB/c 小鼠和 TLR-4 先天性缺损小鼠（C3H/HeJ）研究肝脏 IRI。实验发现，C3H/HeJ 组小鼠肝功能损伤程度、血清 TNF-α 水平显著低于对照组，提示 TLR-4 受体激活，可增加 TNF-α 参与肝脏 IRI 损伤。Zhai 等[9]进一步研究发现，TLR-4 敲除对小鼠肝脏 IRI 有保护作用，而 TLR-2 敲除无此作用。Oyama 等[10]在小鼠心肌 IR 模型中发现，TLR-4 缺陷型小鼠（C57/BL10ScCr）心肌中多形核白细胞（polymorphonuclear，PMN）浸润显著减少，炎症反应减轻，心肌梗死面积较小。Chong 等[11]采用 C3H/HeJ（TLR-4 基因缺失）小鼠复制了心肌 IRI 实验，验证了 TLR-4 介导心肌 IRI 损伤的结论。Wu 等[12]在研究肾脏 IRI 时发现，缺血后肾小管上皮细胞存在 TLR-4 表达和 PMN 浸润，而 TLR-4 缺陷型小鼠在 IR 后肾功能和肾实质损伤明显减轻。同时，在 MyD88 缺陷型小鼠身上观察到和 TLR-4 缺陷型小鼠一样的保护作用，说明 TLR-4 通过 MyD88 依赖性信号通路介导 IRI。后来，Hua 等[13]研究发现，TLR-4 缺失型小鼠保护心肌 IRI 的作用可被磷脂酰肌醇-3-激酶-丝氨酸/苏氨酸激酶（phoshatidy linositol-3-kinase-serine/threonine kinase，PI3K/Akt）抑制剂消除，提示 TLR-4 和 PI3K/Akt 通路存在交叉，TLR-4-/-小鼠抗心肌 IRI 是通过 PI3K/Akt 信号转导通路实现的。

4.2 缺氧诱导因子信号通路

细胞感知氧水平改变，供氧不足时改变细胞生理状态，通过缺氧诱导因子（hypoxia-inducible transcription factor，HIF）氧敏感性转录通路，结合缺氧调控元件（HRE），调控多种基因表达，提高细胞对缺氧的适应性。同时，HIF 在IRI 中也表现为一种有益因子。Natarajan 等[14]通过 siRNA 干扰小鼠微血管内皮细胞 PHDs 表达来增加 HIF 的表达，发现 iNOS 表达也随之增加，IR 后，梗死面积显著减少。然而，iNOS 基因敲除的小鼠无抗 IRI 的作用。Xi 等[15]在体外模型中应用氯化钴激动 HIF，发现能减少梗死面积，而在 iNOS 敲除的小鼠器官中则没有观察到保护作用。这些研究表明，在 IRI 中，HIF 可以上调 iNOS 消除 IR 产生的 ROS 发挥保护作用。

Pachori 等[16]用 RNA 技术诱导大鼠血红素加氧酶 1（heme oxygenase，HO-1）过表达，观察到 HO-1 过表达的大鼠心脏、肝脏等器官在发生 IR 时损伤减轻，这是由于 HO-1 及其催化产生的血胆红素、CO 均具有抗氧化应激损伤的作用。HO-1 催化氧化需消耗大量氧分子，竞争了氧自由基的氧来源，减少氧自由基的产生。胆红素能清除活性氧，在多种疾病中发挥抗氧化作用，而 CO 在一定范围内可减少 ROS 的生成。再灌注时 HIF 上调，诱导 HO-1 表达增加，通过上述途径发挥抗氧化作用，减轻器官的再灌注损伤，这可能是 HIF 抗 IRI 的又一途径。

4.3 促分裂素原活化蛋白激酶途径

促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）途径是介导细胞反应的重要信号系统，参与了细胞生长、发育、分裂、死亡以及细胞间的功能同步等多种生理反应的过程。MAPK 是一类丝氨酸/苏氨酸激酶，由多种同工酶组成，主要包括细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、c-Jun 氨基酸末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和 p38MAPK。

4.3.1 ERK 信号通路 ERK 被认为是经典的 MAPK 信号通路途径。研究发现，ERK 在正常细胞中低表达，而受到 IR 的刺激后，pERK 显著上调。对于 IR 刺激下 ERK 通路的激活，是发挥保护作用还是介导凋亡，学术界尚无定论。

部分学者认为 ERK 通路激活在 IRI 中发挥保护作用。Tao 等[17]研究发现，1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1- phosphate，SIP）通过激活 ERK 促进成年小鼠心肌细胞在 IR 模型中的存活。Yue 等[18]和 Das 等[19]报道激活 ERK 通路可减少 IR 诱发的细胞凋亡，宏观上缩小心肌梗死的面积。ERK 通路可能通过如下几个方面发挥保护作用：①ERK 促进 B 细胞淋巴瘤基因 2（B-cell lymphoma gene 2，Bcl-2）表达，拮抗凋亡蛋白 Bax 表达，减少 caspases-3 活化；②Bcl-2 与 c-myc 共同阻止 p53 入核及其诱导细胞凋亡作用；③ERK 激活核糖体 S6 蛋白激酶（RSK）可使环腺苷酸应答元件结合蛋白（cAMP）磷酸化，协同抑制细胞凋亡，促进细胞存活；④ERK 激活可提高 ATP 水平，恢复供能；⑤可拮抗 JNK，p38 信号通路的促凋亡作用。

另外一部分学者则持相反观点。Stanciu 等[20]、Tsoporis等[21]和 Tong等[22]在各自的研究中发现，激活 ERK 通路会导致培养的细胞的 IRI 加重。更多的研究分析 ERK 可能通过以下途径介导损伤：①ERK 是 p53 的上游信号分子，pERK 可激活 p53 磷酸化，介导细胞凋亡；②ERK 激活后通过 ERK1/2/Elk/Egr-1 通路上调 Egr-1 蛋白，介导 IR 损伤；③ERK 激活 miR-1 和 miR-206 抑制 Hsp60 表达，削弱 Hsp60 保护作用，加重器官 IRI；④ERK 激活可导致活性氧（ROS）产生增加，引起 IRI。

ERKs 作为 MAPKs 中经典通路，参与了细胞生理、病理过程。不同的实验发现 ERK 在 IR 中扮演了截然相反的角色，这可能与 IRI 进程有关。IRI 早期，ERK 的激活可启动内源性的保护机制，而在 IRI 中晚期则以介导细胞损伤为主。

4.3.2 JNK 通路 JNK 位于细胞质中，当 IR 刺激激活 JNK 发生磷酸化时，pJNK 转入细胞核中参与细胞增殖、代谢、凋亡等调控。Ferrandi 等[23]在大鼠心肌 IR 模型中应用 AS601245（JNK 选择性抑制剂）可以减少细胞凋亡和梗死面积。Okuno 等[24]研究发现，脑缺血区的 pJNK 水平增高，应用 JNK 抑制剂 SP600125 可以阻止 Bax 从胞质转入胞核，抑制神经元的凋亡。Carboni 等[25]应用抑制剂 AS601245 处理小鼠神经细胞可有效减轻 IRI。大量实验发现，IR 发生时，JNK 活性显著升高。其抑制剂可降低 IR 引起的细胞凋亡，提示 JNK 参与了 IRI 的进程。

JNK 在 IRI 中介导细胞凋亡主要有两个机制：①转录因子途径：JNK 激活后调控下游因子转录，上调凋亡蛋白表达，介导凋亡途径引起细胞凋亡，如：JNK 活化后进入细胞核，启动转录因子和 ATF-2、AP-1、Elk-1 等，诱发 FasL、TNF-2、BH3-only 蛋白表达上调，激活凋亡程序；②非转录因子途径：部分活化的 JNK 不进入细胞核，不参与转录、调控，而是在细胞质中直接作用于 Bcl-2，引起线粒体通透性的改变，诱发细胞凋亡。

4.3.3 p38 MAPK 信号通路 p38 MAPK 是 MAPKs 中的又一重要通路。活化的 p38 在细胞成活、分化、发育、炎症以及应激反应等生理、病理进程中发挥重要作用。IR 发生时，释放的氧自由基和细胞因子激活 p38 MAPK，将胞外刺激传递到胞内，引起蛋白表达改变，诱发细胞凋亡。研究发现[26-27]，在再灌注前使用 p38 MAPK 特异性阻滞剂 SB203580、FR167653 等可以有效抑制 p38 MAPK 的激活，减少再灌注器官的损伤。p38 MAPK 通过以下几个途径介导细胞凋亡：①上调 c-myc 表达，c-myc 是细胞凋亡的主要诱因；②促进 p53 磷酸化；③参与 Fas 介导的凋亡；④激活 c-Jun 和 c-fos；⑤诱导 Bax 转位；⑥激活 NF-κB，提高 TNF-α 等炎性因子表达，诱发细胞炎性损伤。细胞的炎性损伤和凋亡最终导致再灌注器官的功能障碍和衰竭。

4.4 磷脂酰肌醇-3-激酶-丝氨酸/苏氨酸激酶信号通路

Akt 是PI3K/Akt通路的核心，也是 PI3K 下游的直接作用靶点。许多细胞因子、生长因子、理化刺激均可以活化PI3K，从而磷酸化 Akt，激活下游级联反应和靶蛋白之间的相互作用。

大量研究表明，在 IR 发生时，激活 PI3K/Akt 信号通路可以显著抑制心肌细胞凋亡，缩小梗死面积。Li 等[28]发现，胰岛素与受体结合，可激活其受体的酪氨酸激酶，进一步激活 PI3K/Akt 通路，上调下游靶蛋白 p70S6K 和 eNOS，产生保护心肌的作用。Raphael 等[29]应用异氟烷预处理兔体，发现其心脏在 IRI 中梗死面积和凋亡细胞减少，Western blot 显示 pAkt、pBad 和 Bcl-2 上调，而 Bax 下调，PI3K 抑制剂可拮抗该保护作用，提示 PI3K/Akt 活化后可减少 Bad 介导的细胞凋亡，参与了异氟烷对 IRI 的保护作用。马亚飞等[30]研究发现，葛根素预处理亦可对抗心肌 IRI，这种保护作用可以被 Akt 选择性抑制剂 LY294002 阻断，推测葛根素的保护作用可能也与 PI3K/Akt 信号通路的激活有关。王岩[31]采用分别给予 PI3K、Akt、eNOS 抑制剂的方法干预普伐他汀对心肌 IRI 的保护作用，结果显示 PI3K、Akt、eNOS 均可特异性拮抗普伐他汀对兔心肌 IRI 的保护作用，显示普伐他汀通过 PI3K/Akt/eNOS 信号通路发挥作用。

实验观察到不同种类药物发挥 IRI 保护作用时均激活了 PI3K/Akt 信号通路，而特异性抑制剂拮抗其保护作用，说明 PI3K/Akt 通路的激活对心脏起保护作用。更多研究表明，活化 Akt 能作用于下游 eNOS、Bcl-2、GSK-3β、caspase-9、p70S6K 等多个靶点，并最终减少 mPTP 的开放，稳定线粒体膜，减少促凋亡因子活化，发挥抗凋亡、保护再灌注器官的作用。

5 总结与展望

综上所述，HIF 作为特异性氧敏感性转导通路在缺血及再灌注 2 个损伤环节均发挥重要调节作用。MAPKs 在 IR 时激活，ROS 与 MAPK 通路存在交互作用，ROS 能诱导 MAPK 的激活，同时这些激酶亦可反作用调节 ROS 水平。p38 被证实可以调节线粒体内 ROS 水平，通过 Raf/MEK/ERK 通路对抗线粒体内过多的 ROS 和 Ca2+，减少细胞凋亡。然而 ERK 是否起到细胞保护作用仍然未有定论。另一方面，先天免疫和炎症在 IRI 中已有深入研究，促炎因子和免疫调节因子在 IR 时表达增加。Toll 样受体是这些免疫和炎症诱导物的结合受体，它在炎症诱导的 IRI 中起核心作用。细胞损伤时释放的高迁移率蛋白（HMGB1）是一种 TLRs 配体。ROS 可通过上调 HMGB1，增加其与 TLRs 结合来激活 NF-κB，经 NF-κB 信号介导在 IRI 时调节炎症因子的产生[32]。在诸如脑、肺、肝、肾、肠等器官中也观察到了相似的作用[33]。此外，PI3K/Akt 的激活可以对抗缺氧复氧诱导的心肌细胞凋亡。心肌缺失 TLR-4 小鼠的 NF-κB 结合激活减少以及 Akt 磷酸化水平增加，不易发生 IRI，而使用小分子抑制 PI3K 可以完全消除 TLR-4 缺失小鼠的 IRI 心肌保护作用，提示 TLR-4 和 PI3K/Akt 通路存在交叉[34-35]。

目前，在临床上防治 IRI 并无特效药物，随着 IRI 与细胞信号转导研究的不断深入，对 IRI 发病机制的了解也越发透彻，这为防治 IRI 新药的研发提供了更多崭新的思路。

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浙江省大学生科技创新活动计划（2011R413043）；国家自然科学基金（30971406）

金利泰，Email：jin_litai@yahoo.cn

2012-11-30

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2013.02.009